Автономная некоммерческая организация «Научно-исследовательский институт здоровья» (стр. 2 )

Источники ошибок:

1. Различные фабричные образцы красителей имеют раз­личную силу окраски, поэтому необходимо устанавливать

оптимальную концентрацию и время окраски.

2. Вода должна быть нейтральной реакцией

3. Все краски для окраски должны храниться в темном месте н не взбалтываться.

4. В шкафу с красками для крови нельзя - хранить-щелочи и кислоты.

Методика приготовления препаратов и их окраска.

Кровь для исследования на малярию можно брать вне зависимости от приступа, так как паразиты малярии во Бремя острой фазы инфекции имеются в эритроцитах периферической крови как во время приступа, так и в период нормальной температуры, предшествующей очередному подъему температуры. Кровь берут обычным способом из мя­коти пальца. Предметные стекла должны быть тщательно вымыты.

Кроме мазков при исследовании плазмодиев малярии необходимо брать еще так называемую толстую каплю. Она дает возможность исследовать кровь в более толстом слое, что намного сокращает время исследования и облегчает нахождение паразитов там, где их мало. Поэтому взятие толстой капли должно практиковаться во всех случаях. Мазки крови перед окраской фиксируют. Толстую каплю перед окраской не фиксируют! Капли, на которые уже попал спирт случайно, не годятся для исследования.

Методы фиксации и окраски в мазках крови: мазки фиксируют: время фиксации отдельными фиксаторами раз­личное:

Метиловым алкоголем — 3—5 минут

Ацетоном — 5 минут

Денатурированным спиртом — 10—15 минут

Абсолютным алкоголем — 20—30 минут

Смесь спирта и эфира поровну — 20—30 минут. После фиксации препарат заливают красителем Рома-новского-Гимза и оставляют на 20—40 минут, затем его промывают, сушат и рассматривают под микроскопом. Кро­ме классического способа окраски по Романовскому при­меняется окраска по методу Шуренковой и методу Мошковского. Эти методы могут быть использованы при отсутствии красителя Романовского.

Способ Шуренковой: растворяют отдельно 1 г метиленового синего в 15 мл кипяченной воды и 1,5 г марганцевого кислого калия в 75 мл кипяченной воды и обе жидкости! сливают в колбу, при этом получается осадок. Колбу по­мещают в кипящую водяную баню и выдерживают в ней

20 мин, считая от повторного закипания воды, охладившей­ся от погружения в нее колбы. После остывания раствор фильтруют. Окрашивают двумя растворами.

Приготовление рабочих растворов:

Раствор 1 — описанного выше раствора 1 часть подкисленной кипяченной воды. Подкисленная вода готовите, пу­тем добавления к кипяченной воде 15 капель соляной кислоты (1 часть концентрированной соляной кислоты, 2 части дистиллированной воды) на 200 мл воды.

Раствор 2 — эозина водорастворимого 0,2 г, воды кипя­ченной 200 мл.

Окраска мазков: стекло с фиксированными обычным способом мазком погружают в раствор № 2 на. 15—20 секунд, затем прополаскивают водой и погружают в раствор № 1 на 45—50 секунд, снова прополаскивают водой, про­сушивают и просматривают под микроскопом. Хорошо про­крашенный мазок должен иметь сиреневый цвет. Если он слишком красноват, это значит, что он перекрашен в раст­воре эозина. Для исправления его еще раз на несколько секунд погрузить в раствор № 1. Пересиненные мазки исправ­ляют погружением вторично в раствор № 2.

Окраска толстой капли этим способом: не слишком тол­стую, хорошо размазанную каплю, высушенную на воздухе, без фиксации погружают в N°1 при этом препарат необхо­димо погружать и поднимать. Когда капля из зеленой станет прозрачно голубой, препарат прополаскивают в водой опускают в раствор № 2 и сразу же снова прополаскивают водой. После этого каплю высушивают (не на пламени) и микроскопируют.

В правильно окрашенных препаратах ядра лейкоцитов фиолетовые, хорошо выявлена зернистость в лейкоцитах. Цитоплазма паразитов голубая, ядро вишнево-красное, бо­лее интенсивно окрашенное в молодых стадиях паразита.

Способ Мощковского: берут метиленового синего 1 г, бу­ры—2,5г, дистиллированной воды 100 мл. Краситель и буру растирают в ступке и затем растворяют в воде, раствор кипятят в течении 30 минут, фильтруют. Для окраски препаратов из основного раствора готовят рабочий раствор' 1:10 на дистиллированной воде (раствор— 1). Раствор№ 2 представляет собой 5% раствор. Чтобы раствор не плесневел, к нему добавляют небольшое количество тимола. Тонкие мазки фиксированные, высушенные на воздухе, погружают в раствор № 1 на 30 секунд—1 минуту. Затем их ополаскивают в дистиллированной воде, снова ополаскивают в воде, высушивают на воздухе и исследуют. При этом, спо­собе окраски эритроциты окрашиваются в розовый цвет, ядра лейкоцитов — в фиолетовый, цитоплазма в голубой, ядра паразитов у молодых стадии—в v более взрослых—в бледно-розовый цвет.

Толстая капля — хорошо размазанную, высушенную на воздухе толстую каплю (она не должна быть слишком тол­стой) погружают в раствор.№ 1 на 10 мин. препаоат промывают в дистиллированной воде, погружают в раствор № 2 на 8—10 секунд, снова промывают в воде, высушивают на воздухе и исследуют. В окрашенных этим способом толстых каплях ядра лейкоцитов фиолетово-синие, цитоплазма паразитов—синяя, ядра у молодых стадий паразитов — темно-красная, у более взрослых—бледно-розовая. Если препарат но окрасился, то на 3—5 мин снова погружают в раствор № 1. промывают в дистиллированной воде, снова погружают в раствор № 2 на 8—10 секунд, промывают во­дой, высушивают на воздухе и исследуют.

Если приходится окрашивать старую каплю или очень толстую, то на высохшую каплю наливают каплю дистил­лированной воды, от которой гемоглобин растворяется. Окрашенную воду сливают с препарата, смывают его водой, после него препарат становится синевато-белым. Окрашивают его затем обычно раствором краски 40-60 мин. Рабочий раствор краски Романовского— 1—2 капли основного раствора краски Романовского (товарного) на 1 мл. воды.

ОКРАСКА ПО РАЙТУ

Состав: растворяют в. 100 мл метилового метиловый голубой голубой 0.135, тионин-О. О25, эозин -0.09.

Свойства: темно-синяя жидкость. Огнеопасно. Токсично,-Хранят в плотно укупоренных склянках из оранжевого стекла. Этикетка с надписью «Огнеопасно» и «Яд»Гарантийный срок — 6 месяцев.

Методика; на сухой нефиксированный мазок наливают несколько капель краски, спустя 1 мин. прибавляют столько же капель дистиллированной воды. Через 2—3 мин препарат промывают в воде (около полминуты), пока он и тонком слое не приобретет розового оттенка.

ОСОБЕННОСТИ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ОКРАСКИ МАЗКОВ ДЛЯ ЦИТОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

«Гематологическая цитохимия»Ф. Г. Дж. Хейхоу, Д. Кваглино, Москва, Медицина, 1983 г.

1. В качестве стабилизатора—антикоагулянт можно поль­зоваться: ЭДТА, оксалат, цитрат, гепарин. Гепарин вызы­вает наименьшие морфологические изменения лейкоцитов.

2. Лейкоконцентрат, если клеток 50X10 9/л.

3. Сморщивание мазков или их смывание можно умень­шить если дать им до фиксации полностью высохнуть С24— 48 ч.). Кислая и щелочная фосфатазы обладают общим свойством—способностью освобождать фосфат из многих спиртовых и фенольных фосфомоноэфиров при кислой и

щелочной рН среды. КФ, ЩФ и неспецифические эстеразы являются лизосомальными ферментами. В лимфоцитах вы­явлен параллелизм, выраженная эстеразная активность в Т—клетках активность КФ по спавнению с В-клетками. Сильное увеличение активности КФ происходит в Т-клетках, стимулированных поликлональными активаторами такими как ФГА.

ОКРАСКА НА ГЛИКОГЕН

1. Мазки фиксируются в парах формалина 1 минуту.

2. Заливаются насыщенным раствопом перйодата натрия или калия на 40 минут (в темноте).

3. Смываются дистиллированной водой, сушатся.

4. Заливаются реактивом Шиффа на 9 часа в темноте.

5. Отмываются дистиллированной водой.

6. Докрашиваются гематоксилином или зеленой краской (лихтрюн или бриллиатгрюн 1%—спиртовым).

Приготовление реактива Шиффа: 1 г основного фуксина (или специального фуксина для фуксинсернистой кислоты) растворяют в 200 мл. кипящей Н2О дист. По мере охлаждения в раствop добавляем 1г. метабисульфита калия и 20 мл 1 н. раствора солядай кислоты. Оставляют на сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолчонную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (лучше на холо­де) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригодности реактива).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ЛЕЙКОЦИТАХ (Ш Г. РОСКИНУ, Д. ЛЕСИНОЙ).

ПРИНЦИП: Метод осно­ван на применении красителей, хорошо растворяющихся в жирах и дающих интенсивную окраску. При выявлении липидов жирорастворимыми красителями наилучшие резуль­таты получаются при использовании азокрасителя судана-черного В растворенного в 70° спирте.

Реактивы: Краситель—фиксатор: 50 мл 70 град, спир­та, 20 мл дистиллированной воды и 20 мг а-нафтола смеши­вают в колбе и добавляют судан черный В, до насыщенного раствора сине-черного цвета (приблизительно l-З часть химической пробирки). Раствор нагревают (можно довести до кипения). Раствор сразу же готов к употреблению, стоек. Приготовление 70° спирта: к 100 мл 96% спирта добавляют 39,1 мл дистиллированной воды.

Краска Романовского (или гематоксилин) приготавлива­ется обычным способом.

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Нефиксированный мазок поме­щают в теплый раствор краски-фиксатора и ставят в тер­мостат на 30 мин при температуре 37°. Тщательно в тече­нии 2—3 минут отмывают в 70 градусном спирте. Докраши­вают краской Романовского в течении 15 мин или гемато­ксилином 20 минут. Липиды окрашиваются в черный или коричневый цвет. Ответ дают в единицах, подсчет ведут) на 100 нейтрофилов. Клетки, цитоплазма которых содержит большое количество гранул, оценивают а 3 —резко положительная реакция. Клетки, цитоплазма которых со­держит небольшое количество гранул-черных—оценивается одним крестом — реакция отрицательная.

Каждый ( + ) приравнивается к 1 единице. Подсчитывае­мое - количество-- клеток - умножается па количество единиц и вычисляется общее количество, Нормальное содержание липидов в нейтрофилах 180-200 ед. Клиническое значение: вмазках периферическом кpoвилипиды содержатся у ци­топлазме иейтрофилах в виде крупной зернистости. Боль­шинство нейтрофилов (69—80%) у здоровых людей красят­ся интенсивно (+ + ) и 10 процентов слабо окрашены ( + ). Средний цитохимический показа—2.78. Не­большое количество липидов обнаруживают в моноцитах и тромбоцитах.