Автономная некоммерческая организация «Научно-исследовательский институт здоровья» (стр. 1 )

Автономная некоммерческая организация

«Научно-исследовательский институт здоровья»

сертификационный цикл по специальности

«Клиническая лабораторная диагностика»

ОКРАСКА МАЗКОВ

Для окраски мазков крови, костного мозга, цитологических мазков используются анилиновые красители, которые по разному воспринимаются элементами клетки. Наиболее распространенным:: красителями являются азур - эозин, метиленовын синий, гематоксилин. Готовятся смеси этих кра­сителей, чем достигается оптимальная окраска ядра и ци­топлазмы. Все красители удобно разделить на основные и кислые. К основным красителям относят азур и гематокси­лин, к кислым —эозин. Из-за различного сочетания кра­сителей существует большое разнообразие методов.

Принцип любого метода окраски мазков крови или цитологических препаратов - заключает в себе несколько этапов:

1. Фиксацию элементов к мазку.

2. Окраска элементов биологического материала.

Фиксация мазка предусматривает остановку биологического процесса Ее можно достигнуть вызвав денатурацию белка химическим путем или тепловым. Очень часто для предварительной фиксации препаратов из биологического материала используют тепловую фиксацию над пламенем горелки.

Из химических фиксаторов в лабораторной практике ис­пользуют следующие препараты:

Фиксаторы Время фиксации

1. Метиловый спирт 5 мин.

2. Денатурированный спирт 30 мин.

.3. Этиловый спирт 30 мир.

4. Смесь Никифорова 30 мни.

(спирт: эфир = 1:1)

5. Ацетон 5 мин.

6, Хлороформ 5—6 сек.

7. 1% формалин 1 мин.

8. Фенол

Лучшим фиксатором является метиловый спирт.

Фиксация мазков парами формалина (по П. Ф, Соткину).

В фиксатор помещают стеклянный мостик. На дно экси­катора наливают раствор фенола (90 частей фенола, 10 ча­стей воды).

Мазки помещают на мостик, мазком вниз. Закрывают крышку эксикатора и хорошо притирают.

Мазки в эксикаторе выдерживают строго определенное: время:

при 16—18°С — 20 мин.

при 19—21°С — 10 мин.

при 22—24°С — 5 мин.

при 25—27°С — 3 мин.

при 28—30°С — 0,5-1 мин.

Термометр помещают рядом с эксикатором. После фик­сации мазки выветривают при температуре лаборатории в течение времени фиксации.

Очень хорошо фиксируются мазки следующим раствором; 5 г. сернокислого цинка, 5 г. поваренной соли и воды до 100 мл. Перемешать. Время фиксации этим раствором 2—3 мин. После фиксации мазки сушат на воздухе, затем окра­шивают мазки любым принятым в лаборатории методом.

Для окраски мазков используют азур-эозиновые смеси, гематоксилин эозионвые смеси, азур-метиленовую смесь и другие.

Все предложенные методы окраски мазков основаны на химическом средстве различных частей клетки (ядро, цито­плазма, нуклеолы, зернистость) к определенным анили­новым красителям.

Так ядра клеток, богатых нуклеопротеидами. восприни­мают основные красители (азур I, азур II. метиленовый синий) и цитоплазма клеток—эозин.

Краски, в состав которых входят эозин и азур очень чув­ствительны к реакции дистиллированной воды. РН воды должна быть 7,0.' Если рН воды больше 7,0, то эритроциты окрашиваются в серый цвет, лейкоциты в очень темные то­на. При рН воды больше 7,0 клетки или вообще не окра­шиваются, или преобладают выраженные красные тона.

РН воды можно определить на аппарате Михаэлиса,

рН-метре, унифицированной индикаторной бумагой (универсальный индикатор).

Подготовить нейтральную дистиллированную воду можно путем использования 1% карбоната натрия для кислой воды и 1% уксусной кислоты для щелочной воды.

Лучше для приготовления красителей использовать бу­ферные растворы (фосфатный буфер).

Окраска по Романовскому-Гимза.

Первый способ окраски из готовой краски Романовского-Гимза. Готовая краска Романовского-Гимза состоит из азура II. эозина желтого, метилового спирта и глицерина. Каждую вновь полученную краску методом подбора соотношений краски и воды готовят к употреблению.

Пример: 1 мл Н2О + 6 капель краски. Мазки заливают на 20—30—50 мин.

1 мл Н2О + 4 капли краски. Мазки заливают на 20. 30, 40. 60 мин.

1 мл Н2О + 3 капли краски. Мазки заливают на 20, 30. 40, 50, 60 мин. и т. д. ,

Таким образом подбирают оптимальное время и объем краски, которая будет использоваться для окраски мазков с учетом времени. Найденные величины указывают на бутыле с краской. t

Ход окраски: краску наливают на нефиксированный ма­зок на 1—3 мин., затем на мазок по каплям наливают воду с рН 7,0. Воду наливают таким, образом, чтобы вода не смешалась с краской и не сливалась с мазка. Эта смесь краски с водой остается на 15—30 мин. Затем мазок смы­вается водопроводной водой. Мазки высушивают.

Окраска азур-эозином: В одну бутылку всыпают 1 г. су­хой краски азур-П (смесь равных частей азур I и метиленовой синьки) и добавляют 1 л. дистиллированной воды, и другой бутылке растворяют 1 г. эозина (водного) в 1 л. ди­стиллированной воды. Оба эти раствора красок очень ус­тойчивы при хранении в темном месте. Для повседневной работы 'наливают в небольшие бутылочки эти растворы.

Для окрашивания мазков крови готовят смесь 0,5 мл азу­ра, 0,5 мл эозина и 3 мл. дистиллированной воды; наливают на фиксированный и высушенный мазок на 20—30 мин., после чего смывают и высушивают.

Окраска мазков краской Романовского-Гимза без предварительной фиксации.

Окраска проводится в 2 этапа.

I этап. Приготовление спиртового раствора красителя, вы­полняющего роль фиксатора. 3,8 г сухой краски Романовского-Гимза растворить в 250 мл абсолютного спирта эти­лового или метилового. Раствор поместить в термостат при 37°С на 24 часа (периодически взбалтывать). Затем в крас­ку добавить 250 мл глицерина и опять в термостат на 3— 4 дня. Краску фильтровать и хранить б склянке из темного стекла.

Перед окраской мазков приготовленную краску разводят метиловым спиртом в соотношении 1:3 (2 мл краски + 6 мл метилового спирта). Можно в качестве спиртового раст­вора краски использовать готовую краску Романовского-Гимза после предварительного титрования.

II этап. Приготовление водного раствора краски Романовского-Гимза. Этап краски состоит из 2-х растворов:

I часть: 0,1% р-р азура II (1 г азура, II растворяют в 1 л воды рН 7,0). Краску после приготовления отфильтровать.

II часть: 0,1% р-р желтого водорастворимого эозина (1 г эозина растворить в 1 л воды рН 7,0). Краску отфильтровать. Перед употреблением, т. е. в день окраски мазков готовят смесь этих красок в следующих соотношениях: 9 мл азура II + 8 мл эозина + 17 мл Н2О.

Иногда соотношения азура и эозина берут иные.

Прозерка краски: 1) если ядра лейкоцитов окрашены бледно, добавить больше азура. 2) если эритроциты имеют синеватый оттенок, то берут больше эозина.

Ход окраски: Нефиксированный мазок залить спиртовым раствором красителя краски Романовского-Гимза на 5 мин., не сливая его на мазок, наносят водный раствор краски на 15 мин. Смывают краску водопроводной водой и сушат.

ОКРАСКА ПО ПАППЕНГЕЙМУ

Метод не требует предварительной фиксации, так как ис­пользуется краситель-фиксатор Май-Грюнвальда.

1. Приготовление красится Май-Грюнвальда: 3; г сухой краски Май-Грюнвальд растворить в 1 л. метилового;спирта. Подогреть до 60— 70'С (не. кипятить!). Краску охладить и отфильтровать.

2. Приготовление водного р-ра красителя азур-эозина. 1\. 50 мл Н2О (рН 6,8) прибавить 15 мл азура II 0,1% р-р и 10 мл 0,1% раствор эозина. Водный раствор краски можно приготовить из готовой краски Романовского (5 капель краски + 10 мл Н2О).

Ход окраски: Высушенный, нефиксированный мазок залить на 3 мин красителем-фиксатором Май-Грюнвальда. Не сливая краски, на мазок налить равный объем воды на 1 мин. Смыть водой и залить мазок водным раствором азур-эозиновой смеси на 15 мин (мазки п. к. и к. м., отпечатки лимфоузлов, опухоли), на 5—7 мин, выделения из молочной железы, на 3—5 мин препараты из выпотных жидкостей.

ЭКСПРЕСС-МЕТОД ПО ПАППЕНГЕЙМУ: мазок нефик­сированный залить на 2 мин красителем фиксатором Май-Грюнвальда, смыть водой и на 3 мин затем водный раствор азур-эозин.

Окраска по Лейшману

Приготовление краски фиксатора (смесь Лейшмана):

2,5 г краски Лейшмана (эозин-метиленопый синий, сухой)

растворить в 1 л метанола. Смесь стоит 3 дня при периодическом взбалтывании. Водный раствор Романовского готовится из водного азура II и эозина.

Окраска препаратов: Нефиксированные мазки залить на 4—5 мин 0,25% раствором краски Лейшмана, смыть водо­проводной водой и залить водным раствором краски Романовского на 15—20 мин. Высушить. Смотреть с иммерсией.

Окраска по Алексееву (экспресс-метод).

Метод основан на использовании азур—эозиновойой смеси.

Окраска препарата: нефиксированные мазки залить крас­кой спиртовой Романовского-Гимза на 30 мни, затем добавить Н2О с рН 7,0, подогретой до 50—С0°С, Перемешать краску. Смыть водопроводной водой через 5—6мин. Мазки просушить фильтровальной бумагой.

Оксраска по Филипсону: Берут смесь из одной части краски Романовского и 3 части спирта (ректификата). На не­фиксированный мазок наливают 0,5—I мл смеси на 1.5 мин, затем добавляют равное количество дистиллированной воды, тщательно перемешивают покачиванием препарата и ос­тавляют на 20—30 мин. Смывают водой и высушивают.

Окраска по : — первая краска — в сухой стерильной бутылке в 100 мл дистиллированной воды раст­воряют 0,5 г химически чистого углекислого натрия и 1 г метиленовой синьки. Воду предварительно нагревают до ки­пения и в остывшей воде растворяют соду и краску. Бу­тылку с раствором ставят в термостат на двое суток пои температуре 39°. часто взбалтывая, затем бутылку вынима­ют из термостата и оставляют в темном месте на 5—6 су­ток. Получается основной раствор краски, который приме­няют в разведении 1:10. Для этого берут 1 мл хорошо взболтанного раствора и 9 мл дистиллированной воды. При­готовление второй краски: в бутылке с 100 мл дистиллиро­ванной воды растворяют 0,1 г желтого эозина.

Для окрашивания мазка вливают в мерную пробирку или маленький цилиндр 6 капель разведенного 1:10 основного раствора (краска № 1), доливают дистиллированной воды почти до метки 3 мл, приливают 5—6 капель раствора эо­зина (краска № 2) и полученные 3 мл. краски наливают на 20—30 мин на мазок, который затем смывают водой и высушивают. Для окрашивания нескольких препаратов количество краски и воды соответственно увеличивают, но соблюдают точно процесс смешивания растворов. При не­обходимости получения более щелочной краски увеличивают количество капель краски № 1 и уменьшают количество капель краски № 2. Разведение и смешивание красок про­изводят непосредственно перед окрашиванием.