Автономная некоммерческая организация «Научно-исследовательский институт здоровья» (стр. 3 )

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ В ЛЕЙКОЦИТАХ. МЕТОД ГРЕХЕМА-КНОЛЛЯ

Принцип: Определение перокендазы основано на исполь­зовании бензидина, который в присутствии перекиси водо­рода и пероксидазы переходит в коричневый оксибензидин.

Реактивы: 1. Формалиново-спиртовын раствор (20 мл этилового спирта + 5 мл 40% формалина).

2. Пероксидазный реактив: для этого в пробирку отме­ривают 6 мл 96% раствора спирта и добавляют (на кончике ножа пли стеклянной палочки) бензнднн. Содержимое про­бирки смешивают и добавляют 4 мл 1120 п 0,1 мл 3% перекиси водорода (Н2О2).

Ход определения: Свежий, нефиксированный (фиксируют формалиново-спиртовым раствором 1 mi;h.) мазок крови, не сливая (на 5 мин. заливают приготовленной смесью № 2, после чего хорошо промывают водопроводной водой и за­ливают краской Романовского или гематоксилином на 20 мин., для. докрашивания ядер клеток. Цитоплазма клеток, содержащих пероксидазу, окрашивается в золотистый или коричневый цвет. Ответ дают по степени интенсивности ок­раски (0, 1, 2, 3). ,

Клиническое значение: В кровяных элементах пероксида-за содержится преимущественно в цитоплазме гранулоци-тов. Среди нейтрофилов 3—16% окрашены резко положи­тельно ( + + ±+ ), 60 — 90 процентов положительно (4_ + - i - + ) .......и остальные слабо положительно

( + ). Средний цитохимический показа—2.06.

ПОДСЧЕТ ЭРИТРОЦИТОВ В СЧЕТНОЙ КАМЕРЕ

Специальное оборудование: Микроскоп, камера. Горяева. Счетная камера состоит из толстого прямоугольного стекла с сеткой, выгравированной непосредственно на нем или на специальной наклееной для этого стеклянной пластинке.

Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов (15x15). Большие квадраты, расчерченные вертикально, горизонтально на 16 малых квадратов, чередуются с квадратами, раз­деленными только горизонтальными или только вертикаль­ными линиями, н с квадратами без линий. Перед заполнением камеры ее, так же как и покровноеное стекло, необходимо вымыть водой и насухо вытереть. За­тем шлифованное стекло притереть к камере так, чтобы появились радужные так называемые ньютоновы кольца.

Заполнение камеры: Кровь, взятую в пробирки с 4,0 мл 0,9% необходимо перед заполнением камеры встряхнуть неколько раз, держа пробирку вертикально. После этого концом круглой стеклянной палочки отбирают из пробирки, наклоняя ее, каплю жидкости к заполняют камеру, . так чтобы вся поверхность, на которой нанесена сетка, была заполнена жидкостью без затекания ее в бороздки и без пузырьков воздуха.

После заполнения камеру оставляют на 1 мин. в. покое для оседания форменных элементов. Затем камеру кладут на столик микроскопа, который должен быть строго гори­зонтальным, и приступают к подсчету форменных элементов при малом увеличении микроскопа (объектив 8х, окуляр 10х или 15х). Подсчет следует производить при затемненном поле зрения.

При гемолитических и пернициозной анемиях рекомендуется считать эритроциты сейчас же после из взятия, так как при длительном хранении они могут частично разрушиться. Эритроциты считают в 5 больших кпадратах (5x16), расположенных по диагонали. Подсчету подлежат эритроциты, лежащие внутри маленького квадрата и те, которые находятся на левой н верхней ли­ниях его или касаются их с той и другой стороны. .Эритроциты, расположенные па правой и. нижней линиях, или ка­сающиеся их с обеих сторон, не считают, так как они будут сосчитаны в следующем квадрате. Результаты подсчета в каждом большом квадрате откладываются на П-клавншном счетчике или записывают в столбик и затем суммируют их.

Вычисление количества форменных элементов в 1 мл крови для всех сеток производится по следующей формуле:

где % — количество форменных элементов 1 мкл крови; а — количество форменных элементов, сосчитанных в опре­деленном количестве малых квадратов; б — количество со" считанных малых квадратов; В — степень разведения кро­ви; 1-4000 мкл — объем малого квадрата; умножая на 4000, приводим к объему 1 мкл крови.

Источники ошибок: 1. Образование сгустка. Брать кровь и размешивать ее с разводящей жидкостью нужно быстро, чтобы не образовался сгусток, который увлекая часть клеток, снижает результата исследования.

2. Несоблюдение условий, обеспечивающих правильную высоту камеры.

3 Несвоевременный подсчет эритроцитов сразу, не выжи" дая 1 мин после заполнения камеры кровью; клетки при этом не успевают оседать на дно. Результаты получаются ниже действительных.

4. Недостаточное количество подсчитанных квадратов.

5. Плохо вымытые капилляры и недостаточность в сушке пробирок.

6. Недоброкачественность разводящего раствора, вызывавающий гемолиз эритроцитов.

ПОДСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА ТРОМБОЦИТОВ

ПОДСЧЕТ В КАМЕРЕ: Принцип. Метод основан на под­счете тромбоцитов в 1 мкл крови при постоянном разведе­нии крови и определенном объеме счетной камеры с использованием фазово-контрастного устройства.

Оборудование: 1. Микроскоп. 2. Фазово-контрастное уст­ройство (КФ—4 или любое другое). 3.. Лампа осветительная к. микроскопу (ОИ-— 7, ОИ—18). 4. Камера Горяева. 5. Силиконированные или пластиковые пробирки.

Реактивы: 1) 3 Г новокаина,0,25 г хлорида натрия. 0,025 г. фурацилина разводят в 100 мл дистиллированной воды; или 2.) 1% раствор оксалата аммония. Раствор кипятят и фильтруют. Хранят в холодильнике.

Ход определения: 0,02 мл крови из пальца помешают в силиконированную или пластиковую) пробирку с 4 мл раствора 1 или 2. Оставляют на 25—30 мин. для гемолиза эритроцитов. После повторного перемешивания заполняют камеру Горяева, которую поме­щают во влажную камеру. Через 5 мин. подсчитывают ко­личество тромбоцитов в 25 больших квадратах.

Расчет: Количество тромбоцитов в 1 мкл крови опреде­ляют но формуле:

где а — количество тромбоцитов, подсчитанных в 400 малых квадратах: 200 — разведение крови; 4000 — множи­тель, приводящий результат к объему 1 мкл, исходя из объема малого квадрата; 400 — число отсчитанных малых квадратов. Практически подсчитанное число тромбоцитов в 400 малых квадратах умножают на 2000.

Подсчет тромбоцитов в мазках:

Унифицированной считается окраска ретикулоцитов и тромбоцитов по .

Реактивы: Цитрат натрия (трех-замещенный) Азур II краска хлорид натрия.

В колбу на 100 помещают 1 гр. Азур II п заливают ра­створом, состоящим из 5 г цитрата натрия, 0,4 г хлорида натрия и 45 мл дистиллированной воды. Колбу ставят в термостат на 2 дня при 37", периодически перемешивая жид­кость, для ускорения растворения краски, со можно нагреть на электроплите с асбестовой сеткой 10—15 мин. (по не кипятить), охладить до комнатной температуры, про­фильтровать.

Фильтрат используют как рабочий раствор, сохраняя в темном месте. Краска может созревать при комнатной тем­пературе в течении 7 дней, при ежедневном ее перемешивании.

Методика окраски: В меланжер для лейкоцитов, набирают раствор краски до метки. 1 и кровь до 4-5 объема ампулы смесителя. Жидкость из капиллярной части выдувают на ватный тампон, а оставшуюся в ампульной части смесь крови с краской трижды выдувают на часовое стекло и екозь - набирают в смеситель. Все манипуляции проделывают с предельной быстротой. Смесь крови с краской оставляют в смесителе на 30 мин. (можно оставлять на 1—6 часов), который кладут в горизонтальном положении. Затем смеси­тель встряхивают 2 мин., 2 капли из капилляра сливают, а из оставшейся смеси делают тонкие мазки.

Эритроциты окрашиваются в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-сетчатая субстанция в синий цвет, а кровяные пластинки в синеватый цвет.

После суправительной окраски мазки можно докрасить одним из обычных способов окраски (по Романовскому).

Эритроциты окрасятся в бледнорозовый цвет, ретикулоциты будут содержать фиолетово-красную субстанцию, а тромбоциты — в фиолетовый цвет.

Существует 4 степени созревания ретикулоцитов:

I ст. — зернисто-сетчатая субстанция в виде клубка или глыбки.

II ст. — зернистость в виде густой сети.

II1 ст. — отдельные нити.

IV ст. — отдельные зернышки.

И норме 80°/° ретикулоцитов 3—4 степени.

Вместо меланжеров можно пользоваться пробирками. В капилляр от аппарата Панченкова набирают до - метки «50» краску и помещают ее в пробирку, тем же капилляром дважды набирают кровь до метки «0». Смесь крови с краской тщательно перемешивают и оставляют на указан­ное выше время. Затем делают мазки.

Резистентность эритроцитов

Для оценки физико-химических свойств эритроцитов исследуют стойкость (резистентность) эритроцитов к различным воздействиям. Наибольшее распространение в клинической практике получило исследование осмотической резистентности эритроцитов.

Унифицированный метод определения осмотической резистентности эритроцитов в модификации (1974).

Принцип

Количественное определение степени гемолиза эритроцитов в забуферных гипотонических растворах хлорида натрия.

Реактивы

Основной раствор (по своей осмотической концентрации соответствует 10 % раствору хлорида натрия) имеет рН 7,4, состав раствора: двузамещенный фосфат натрия (Na2HPО4)—27,31 г (или Na2HPО4*2H2O— 34,23, г), однозамещенный фосфат натрия (NaH2PО4*2H2О)—4,86 г, хлорид натрия— 180 г, дистиллированная вода — до 2 л. Раствор можно хранить в закрытой посуде в холодильнике в течение нескольких месяцев.

Основной раствор разводят в 10 раз и получают раствор, соответствующий по своей осмотической концентрации 1 % раствору хлорида натрия. Из этого раствора готовят рабочие растворы хлорида натрия следующих концентраций: 0,85; 0,75; 0,70; 0,65; 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20; 0,10%. Можно приготовить по 100 мл этих рабочих растворов и сохранять их в холодильнике. Годны в течение 2 нед.

Специальное оборудование

Фотоэлектроколориметр. Термостат на 37 °С.

Ход определения

В две стерильные пробирки с предварительно внесенными 2 каплями гепарина берут по 1,5 мл крови, перемешивают и одну используют для исследования, вторую — оставляют на сутки в термостате. В ряд центрифужных пробирок (14 штук) разливают по 5 мл рабочих растворов хлорида натрия концентрации от 1 до 0,10 %. В каждую центрифужную пробирку добавляют по 0,02 мл перемешанной гепаринизированной крови и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Центрифугируют смесь крови с растворами хлорида натрия при 2000 об/мин в течение 5 мин. Из каждой пробирки сливают надосадочную жидкость и измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы.