Холостая проба — надосадочная жидкость в пробирке, содержащей 1 % раствор хлорида натрия.
Расчет
За 100% гемолиз принимают гемолиз в пробирке, содержащей 0,1 % раствор хлорида натрия. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, принятой за 100 %, по формуле:
Процент гемолиза=Ех*100 / Е1, где
Е1 — экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия;
ЕХ — экстинкция исследуемой пробы;
100 — процент гемолиза в пробирке с 0,1 % раствором хлорида натрия.
На следующий день повторяют исследование с кровью, инкубированной 24 ч при 37 °С.
Нормальные величины
У здоровых в свежей крови начало гемолиза отмечают при концентрации хлорида натрия 0,50—0,45 %, а полный гемолиз — при 0,40—0,35 % растворе хлорида натрия.
Клиническое значение
Исследование проводят при подозрении на гемолитическую анемию. Понижение осмотической резистентности, т. е. появление гемолиза эритроцитов при более высокой, чем в норме, концентрации хлорида натрия (0,70—0,75%), наблюдается при наследственном микросфероцитозе и некоторых наследственных несфероцитарных гемолитических анемиях, а также иногда при аутоиммунной гемолитической анемии. В ряде случаев понижение осмотической резистентности выявляется только при исследовании инкубированной крови. Повышение осмотической резистентности характерно для талассемии, гемоглобинопатий.
Литература.
В кн.:Справочник по функциональной диагностике / Под ред. .— М., Медицина, 1970, с. 401
Морфологический анализ препаратов с помощью красителей производства НПФ «Абрис+». В медицинской практике наибольшее распространение имеет общеклинический анализ крови, который включает определение концентрации гемоглобина, подсчет содержания эритроцитов, вычисление цветового показателя, подсчет количества лейкоцитов, лейкоцитарной формулы и исследования скорости оседания эритроцитов. Изменения крови при заболеваниях крайне разнообразны и зависят от тяжести процесса, общей реактивности организма и сопутствующих осложнений. При гематологической патологии исследования клеток крови приобретают первостепенное диагностическое значение. Использование результатов исследования крови составляет неотъемлемое звено процесса диагностики и последующего наблюдения за результатами развития патологического процесса на фоне проводимых лечебных мероприятий. Важным аспектом обследования является внимательное и полное изучение клеточной морфологии. Почти каждое заболевание, поражающее клетки крови, может быть визуализировано либо в форме цитологических изменений морфологии клеток, либо сдвигами распределения разных типов клеток. Разные области медицины объединяют методы исследований и постановки диагноза, а именно – морфологический анализ окрашенных препаратов с помощью микроскопов. Анализ включает в себя три пункта:
Приготовление препаратов возможно двумя способами: ручным и с помощью автоматов и центрифуг. Существуют автоматические устройства для приготовления и окраски мазков, которые позволяют стандартизовать условия и повысить качество препаратов. Автоматический способ пока не нашел широкого распространения в наших лабораториях, поэтому напомним некоторые постулаты ручного метода. Правильная оценка морфологических особенностей крови возможна лишь на хорошо приготовленных и надлежащим образом окрашенных мазках. Предметные и покровные стекла должны быть безупречно вымыты и обезжирены. Также очищают и обезжиривают покровные стекла, которыми делается мазок. Мазки делают на предметных стеклах с помощью более узкого предметного шлифованного стекла или шпателя При изготовлении мазка для подсчета лейкоцитарной формулы угол наклона стекла должен составлять 24є, а время движения по предметному стеклу 1 сек. Оптимальный объем наносимой крови составляет в этом случае 4 мкл. Для получения мазка в виде монослоя угол наклона следует уменьшить до 16є, скорость движения замедлить до 2 сек, каплю крови уменьшить до 3 мкл. Мазок крови, пригодный для измерения диаметра эритроцитов и изучения их морфологии должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины, т. е. располагаться на 1-1,5 см от краев, занимать 2/3 длины стекла и оканчиваться “метелочкой”. Толстые, густо-розовые мазки не следует использовать, т. к. в них морфология клеток плохо различима. После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска. При медленном высыхании может изменяться морфология клеток крови. Мазки должны быть хорошо высушены на воздухе, что позволит избежать сморщивания и смывания их со стекла во время фиксации. Препараты фиксируют сразу после высушивания на воздухе. Если использовался антикоагулянт, то нужно помнить, что несоответствие концентрации антикоагулянта к объему взятой крови, недостаточно тщательное смешивание могут привести к значительным ошибкам, в том числе повлечь за собой неточное определение концентрации клеточных элементов, искажение морфологической структуры клеток. Кровь с антикоагулянтом может сохраняться при 4єС в течение 24 часов без каких-либо существенных изменений числа и морфологии клеток. Тем не менее, гематологические исследования рекомендуется проводить как можно раньше, так как патологические клетки часто менее устойчивы к хранению. Мы подошли к главному вопросу в процессе приготовления препаратов. Это выбор красителей. При создании нашей продукции мы руководствовались следующими характеристиками клеток, которые должны быть выявлены после применения красителей:
Именно эти параметры качества окраски мазков периферической крови, костного мозга и др. биопрепаратов, были заданы при создании красителей серии “Диахим - Гемистейн”, включившие в свой состав: красители-фиксаторы по Май- Грюнвальду, типа Лейшмана, а также краситель по Романовскому двух квалификаций - “профессионал”, предназначенный для окраски периферической крови, костного мозга, различных биоматериалов, для докрашивания хромосом и т. д., и “классик”- предназначенный для окраски периферической крови. Представленные красители были испытаны на кафедре клинической лабораторной диагностики Санкт - Петербургской медицинской академии последипломного образования, в лабораториях Клинического центра передовых медицинских технологий, Санкт - Петербургского государственного университета им. . Окрашивались препараты следующих биоматериалов: периферической крови, костного мозга, пунктатов лимфатических узлов, ликвора и выпотных жидкостей. Для разведения красок и смывания их рекомендуется использовать смесь для приготовления буферного раствора, предлагаемую нашей фирмой, с рН 6,8-7,2. Результатом проделанной работы явились следующие выводы: · Наилучшим способом окраски препаратов периферической крови и костного мозга, а также лимфатических узлов красителями серии “Диахим- Гемистейн”, производства фирмы “Абрис+” можно считать метод Паппенгейма-Крюкова, а именно: комбинированная окраска фиксатором - красителем по Май-Грюнвальду и красителем Романовского. Рекомендуется погружать мазки в фиксатор и выдерживать в течение 2 минут. В качестве фиксатора можно использовать и фиксатор - краситель типа Лейшмана в течение 3 минут. Последующую докраску производить раствором красителя по Романовскому производства нашей фирмы. · Ценным качеством красителей фирмы “Абрис+” является возможность использовать фиксатор - краситель по Май-Грюнвальду в качестве фиксатора и для последующего докрашивания мазков. Данный краситель был успешно использован и для окраски мазков крови и костного мозга в аппарате “НЕМА ТЕК” фирмы “Bayer” вместо стандартной краски, предлагаемой в наборах к названному аппарату. · Разные биоматериалы требуют своего режима окраски. Так для окраски выпотных жидкостей лучшим, по нашему мнению является фиксатор по Май- Грюнвальду, причем фиксация длится не более 1 минуты, с последующей окраской красителем по Романовскому в разведении 1 : 10 и даже 1: 15 в течение 3 мин. Обращаем ваше внимание на то, что каждая новая партия красителя требует отработки своего режима окраски, даже если они применяются для одного и того же биоматериала. Препараты костного мозга и лимфатических узлов требуют индивидуального подхода к режиму окраски в зависимости от клеточности материала. На примере диагностики сложных гематологических заболеваний мы хотели бы продемонстрировать свойства красителей производства НПФ “Абрис+”. Для окраски препаратов был использован метод Паппенгейма - Крюкова. В качестве фиксатора использован краситель “Диахим-Гемистейн-М Г” (по Май-Грюнвальду) и фиксатор-краситель “Д-Г-Лейшман” (типа Лейшман), окраска производилась красителем “Д-Г-Романовский” - профессионал (по Романовскому). Не смотря на получившее в последнее время распространение в лабораториях счетчиков форменных элементов крови, наиболее часто подсчет тромбоцитов осуществляется в мазках крови, приготовленных с использованием трилона Б. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с пересчетом на 1 мкл крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов. Приготовление препаратов Реактивы:
Смешивают кровь с 6% раствором ЭДТА. Для этого реактив, взятый капилляром Панченкова до метки «75» вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки «0». Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, достаточной величины - т. е. располагаться на 1-1,5 см от краев, занимать 2/3 длины стекла и оканчиваться «метелочкой». Толстые, густо-розового цвета мазки не следует использовать, т. к. в них морфология клеток плохо различима. Фиксируют мазки раствором Май-Грюнвальда 2-3 мин. Окрашивают раствором Романовского-Гимзы 30-45 мин (разведение из расчета примерно 1 капля на 1 мл дистиллированной воды: должно устанавливаться опытным путем для каждой новой партии красителя). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолированно!). Тромбоциты в мазках выглядят в виде фиолетовых округлых образований размером 4 мкм с отчетливо видимой центрально расположенной зернистой частью - грануломером и более светлой периферической незернистой зоной – гиаломером. Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны не менее 1000 эритроцитов. Окраска ретикулоцитов При многих гематологических заболеваниях необходимо оценить эффективность эритропоэза. Постоянство процента ретикулоцитов крови в норме позволяет по количеству ретикулоцитов судить об интенсивности эритропоэза. Одним из очень информативных, но крайне "капризных" исследований является подсчет ретикулоцитов. Время созревания ретикулоцитов составляет 4,5 дня, из них в течение 2-3 дней они созревают в периферической крови. Название обусловлено присутствием в цитоплазме сетчатого вещества – ретикулофиламентозной субстанции, представляющие собой остатки РНК и митохондрий. Эта субстанция выявляется при суправитальной (без предварительной фиксации) окраске клеток. Существуют два способа окраски клеток крови: · На чистое и ровное и слегка подогретое предметное стекло наносится краситель, так же как это делается с кровью при получении мазков. Краска ложится тонким слоем, придающим стеклу лиловатый оттенок. На таком окрашенном стекле делается обычным способом мазок исследуемой крови и стекло с влажным мазком немедленно помещается во влажную камеру, где и остается 15-20 минут, лучше до полного высыхания препарата, после чего исследуется под микроскопом. Однако этот способ очень трудоемок и не всегда с его помощью получаются препараты, пригодные для исследования, поэтому в нашей фирме разработан краситель для суправитальной окраски ретикулоцитов пробирочным способом «ЦитоСтейн-РТК»: · смешать в пробирке раствор красителя и кровь в соотношении 1:1 - 1:4. Выдержать при комнатной температуре в течении 30-40 минут. Приготовить мазки и микроскопировать. Цитология – область, где традиционно реагенты готовились в лабораториях, предавая рецептуру и секреты из поколения в поколения врачей. Мы тщательно изучили эти методики и запустили промышленное производство красителей для цитологов, что значительно упрощает им работу и стандартизирует хотя бы в этой области приготовление препаратов. Фиксация цитологического материала. Фиксация цитологического материала является важным этапом исследования, т. к. она позволяет сохранить структуру клеточных элементов. Поэтому ее следует применять как можно раньше после получения материала. Фиксации подвергаются мазки, высушенные на воздухе. Лучшим фиксатором для цитологических препаратов считается метанол, и фиксация продолжается от 3 до 10 мин. Широко распространена фиксация мазков в смеси Никифорова, в 96% или 100% этиловом спирте. При получении материала с примесью крови можно использовать фиксацию мазков в смеси Карнуа. Окраска цитологических препаратов. В цитологической практике используются как обычные гистологические методы окраски, так и гематологические, а также специальная окраска по Папаниколау. В зависимости от материала, окрашивание проводят либо гематоксилином и эозином, либо азур-эозиновыми красителями. Среди наиболее частых применяемых гематоксилинов можно упомянуть красители Майера, Карацци, Эрлиха. Для каждого красителя нужно выбирать свой режим окраски, производить контроль окрашивания под микроскопом. Окрашивание производится в течение 5-20 минут и в результате после промывания водой краситель избирательно окрашивает ядра с синим оттенком. Эозином цитоплазма окрашивается в розовый цвет. Красители можно использовать неоднократно, соблюдая условия хранения, чистоту препаратов и инструкцию по использованию. У нас появилась новинка, которую давно ждали врачи-цитологи – набор для окраски по Папаниколау, используемый в нем метод окраски по Папаниколау является наилучшим для гинекологических мазков, так как этот метод позволяет оценить степень созревания цитоплазмы. В последнее время нашли распространение исследования, позволяющие с помощью анализаторов изображений перевести многие полуколичественные методы исследования в количественные, что позволяет упростить диагностику злокачественных заболеваний и произвести математический анализ ферментативных реакций, происходящих при этих процессах. Речь идет, например, о цитохимических реакциях в клетках крови и костного мозга. Для этих целей в нашей фирме разработаны и уже получили широкое распространение коммерческие наборы для основных цитохимических реакций, используемых в онкогематологии Предложена достаточно широкая панель цитохимических маркеров, охватывающая все обязательные цитохимические реакции. В состав наборов включены реагенты в оптимальной расфасовке и упаковке, и инструкция, позволяющая осуществить последовательную постановку реакции, а также содержащая рекомендации по оценке полученных результатов. Наборы для основных типов цитохимических реакций: «Диахим-ЦитоСтейн-МПО» (набор для определения миелопероксидазы в лейкоцитах), «Диахим-ЦитоСтейн-ПАС» (набор для определения гликогена в лейкоцитах), «Диахим-ЦитоСтейн-СЧ» (набор для определения фосфолипидов в лейкоцитах), «Диахим-ЦитоСтейн-НЭ» (набор для определения неспецифической эстеразы в лейкоцитах), «Диахим-ЦитоСтейн-ХЭ» (набор для определения хлорацетатэстеразы в лейкоцитах), «Диахим-ЦитоСтейн-ЩФ» (набор для определения щелочной фосфатазы в лейкоцитах), «Диахим-ЦитоСтейн-КФ» (набор для определения кислой фосфатазы в лейкоцитах). Также в области генетического анализа краситель «Диахим-ГемиСтейн-Р Профессионал» используется для окраски хромосом как при традиционной окраске, так и при специальных методах для выявления бендов. Таким образом, только правильно приготовленный и окрашенный препарат может использоваться для морфологического анализа. Окрашенные клетки должны быть узнаваемы и нести максимум информации, необходимой для постановки диагноза. |
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
