Фармакогнозия (стр. 8 )

Реакция Легаля. Готовят два раствора: 1 — 5%-ный раствор нитропруссида натрия; 2 — 10%-ный раствор едкого натра. Сухой остаток очищенного извлечения растворяют в 0,5 мл 100%-ного метилового спирта. Полученный раствор вливают в пробирку и добавляют 1—2 капли раствора 1. Затем, осторожно (не взбалтывая!) по стенке добавляют 1—2 капли раствора 2. На границе 2 растворов появляется красное окрашивание в виде кольца.

Задание 8. Определение количественного содержания сердечных гликозидов в листьях наперстянки (ГФ ХI, ст.14, стр. 253)

Запишите в лабораторный журнал схему методик количественного определения сердечных гликозидов в растительном сырье и дайте теоретическое обоснование каждому этапу работы.

Методика количественного проведения эксперимента биологическим методом.

Активность листьев наперстянки определяют биологическим методом на лягушках или кошках по сравнению с Государственным стандартным образцом (ГСО) экстракта наперстянки.

Испытание на лягушках. Испытание проводят на травяных лягушках, вводя растворы в лимфатические бедренные мешки (под кожу) или в сердце (в полость желудочка), либо на водяных, вводя растворы в сердце (в полость желудочка) или в вену.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 7 мм, и сушат в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре 40-60 град. С. Измельченное и высушенное сырье в количестве 5 г экстрагируют 110 мл 95% спирта в аппарате Сокслета в течение 6-8 ч. Извлечение собирают в цилиндр вместимостью 100 мл и доводят объем 95% спиртом до метки (1:20).

Стандартный и испытуемый образцы готовят в день опыта.

Для подкожного введения к 2 мл ГСО экстракта наперстянки прибавляют 6 мл воды (1:4).

Для внутрисердечного или внутривенного введения к 2 мл ГСО экстракта наперстянки прибавляют 2 мл воды, упаривают на кипящей водяной бане до 2 мл и доводят объем водой до 8 мл.

20 мл спиртового извлечения (1:20) листа наперстянки выпаривают на кипящей водяной бане до 2 мл и доводят объем водой до 20 мл. Образующуюся при этом муть или осадок не отфильтровывают, а прибавляют 1-2 капли 5% раствора натрия гидрокарбоната. Полученное таким образом спиртоводное извлечение (1:20) испытывают на лягушках.

Определив наименьшие дозы стандартного и испытуемого образцов, вызывающие систолическую остановку сердца у большинства лягушек (в миллилитрах на массу травяной лягушки или миллилитрах на 1 г массы водяной лягушки), вычисляют содержание ЛЕД в 1 г листа наперстянки.

Испытание на кошках. Из измельченных и высушенных листьев наперстянки готовят настой в соотношении 1:200. Для этого 1 г листьев помещают в инфундирный аппарат, обливают 200 мл кипящей воды и настаивают в течение 15 мин на водяной бане при температуре 90 град. С и частом взбалтывании. Затем настой охлаждают и фильтруют. К фильтрату прибавляют 1,8 г натрия хлорида и доводят объем настоя водой до 200 мл.

Стандартный образец экстракта наперстянки разводят в день опыта 0,9% раствором натрия хлорида в соотношении 1:30.

Устанавливают смертельную дозу настоя в миллилитрах на 1 кг массы кошки (для каждого животного в отдельности) и рассчитывают активность настоя в сравнении с ГСО экстракта наперстянки или вычисляют содержание КЕД в 1 г сухих листьев.

Методика количественного определения ланатозидов А, В, С в листьях наперстянки шерстистой — Folium Digitalis lanatae хроматографическим методом.

Методика основана на хроматографическом разделении сердечных гликозидов с последующим спектрофотометрическим определением.

5 г измельченного сырья (точная навеска) (сито с диаметром отверстий 1 мм) помещают в склянку темного стекла с притертой пробкой, заливают 50 мл 80%-ного метилового спирта и настаивают в течение 24 ч. Жидкость отфильтровывают на воронке Бюхнера и берут для исследования 40 мл извлечения (что соответствует 4 г сырья). Извлечение упаривают на водяной бане под вакуумом при температуре 50—60 С до удаления спирта. К оставшемуся объему (34 мл) добавляют 5—7 мл воды и помещают в делительную воронку. Водный раствор очищают четыреххлористым углеродом 5 раз по 10 мл. Из очищенного водного раствора гликозиды извлекают смесью хлороформа и изопропанола (3:1) 4 раза порциями

по 10 мл. Полноту извлечения гликозидов контролируют реакцией Легаля. Хлороформно-изопропанольное извлечение обезвоживают сульфатом натрия и фильтруют через бумажный фильтр. Сульфат натрия на фильтре промывают 5 мл обезвоженной смеси, которую присоединяют к фильтрату и отгоняют досуха под вакуумом на водяной бане при 50 °С. Сухой остаток количественно переносят в откалиброванный пикнометр вместимостью 3 мл с помощью смеси хлороформ — метиловый спирт (1:1). Полученный раствор подвергают хроматографированию.

Хроматография проводится в тонком слое сорбента (тальк). На подготовленной хроматографической пластинке размером 13 X 18 см намечают стартовую линию на расстоянии 1,5 см от нижнего края. На стартовую линию пипеткой с оттянутым в капилляр носиком наносят два пятна раствора гликозидов по 0,01 мл и пятно (0,01 мл) — раствор абицина (≪свидетель≫). Пластинку помещают в камеру и хроматографируют восходящим способом 30—35 мин. Длина пробега подвижной фазы 12 см. В качестве под-

вижной фазы используется система: хлороформ — этиловый спирт — бензол — формамид (59 : 10 : 30 : 1). Пластинку высушивают на воздухе 5 мин, затем 10 мин в сушильном шкафу при t — 120 °С. Одну половину пластинки (пятно ≪свидетеля≫ и 1 пятно извлечения) обрабатывают 25%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в этиловом спирте с добавлением 0,2 % хлорамина Т. После обработки пластинку высушивают 10 мин в сушильном шкафу при t = 120 °С (рис. 6). Ланатозиды проявляются в виде пятен серо - синего цвета. Точные границы устанавливают в ультрафиолетовом свете. Ланатозид А обладает ярко-желтой флуоресценцией; В — зеленовато-голубой; С — голубой.

На второй половине пластинки (необработанной) пятна ланатозидов отмечают по проявленной полосе и стандарту. Rf пятен ланатозидов в этой системе: А — 0,74; В — 0,43; С — 0,24. После установления границ пятна ланатозидов А, В, С снимают с пластинки, количественно переносят на стеклянный фильтр № 4 и элюируют 20 мл смеси хлороформ — метиловый спирт (1 : 1). Элюат упаривают досуха на водяной бане под вакуумом при t = 50—60 °С. К сухому остатку добавляют 5 мл ксантгидролового реактива, нагревают 5 мин на кипящей водяной бане, охлаждают 5 мин в холодной воде и выдерживают 15—20 мин при ком - смесью хлороформа и изопропанола (3:1) 4 раза порциями по 10 мл. Полноту извлечения гликозидов контролируют реакцией Легаля. Хлороформно-изопропанольное извлечение обезвоживают сульфатом натрия и фильтруют через бумажный фильтр. Сульфат натрия на фильтре промывают 5 мл обезвоженной смеси, которую присоединяют к фильтрату и отгоняют досуха под вакуумом на водяной бане при 50 °С. Сухой остаток количественно переносят в откалиброванный пикнометр вместимостью 3 мл с помощью смеси хлороформ — метиловый спирт (1:1). Полученный раствор подвергают хроматографированию. Хроматография проводится в тонком слое сорбента (тальк).

На подготовленной хроматографической пластинке размером 13 X 18 см намечают стартовую линию на расстоянии 1,5 см от нижнего края. На стартовую линию пипеткой с оттянутым в капилляр носиком наносят два пятна раствора гликозидов по 0,01 мл и пятно

(0,01 мл) — раствор абицина (≪свидетель≫). Пластинку помещают в камеру и хроматографируют восходящим способом 30—35 мин. Длина пробега подвижной фазы 12 см. В качестве подвижной фазы используется система: хлороформ — этиловый спирт — бензол — формамид (59 : 10 : 30 : 1). Пластинку высушивают на воздухе 5 мин, затем 10 мин в сушильном шкафу при t — 120 °С. Одну половину пластинки (пятно ≪свидетеля≫ и 1 пятно извлечения) обрабатывают 25%-ным раствором трихлоруксусной кислоты в этиловом спирте с добавлением 0,2 % хлорамина Т. После обработки пластинку высушивают 10 мин в сушильном шкафу при t = 120 °С (рис. 6). Ланатозиды проявляются в виде пятен серо-синего цвета. Точные границы устанавливают в ультрафиолетовом свете. Ланатозид А обладает ярко-желтой флуоресценцией; В — зеленовато-голубой; С — голубой. На второй половине пластинки (необработанной) пятна ланатозидов отмечают по проявленной полосе и стандарту. Rf пятен ланатозидов в этой системе: А — 0,74; В — 0,43; С — 0,24. После установления границ пятна ланатозидов А, В, С снимают с пластинки, количественно переносят на стеклянный фильтр № 4 и элюируют 20 мл смеси хлороформ — метиловый спирт (1 : 1). Элюат упаривают досуха на водяной бане под вакуумом при t = 50—60 °С. К сухому остатку добавляют 5 мл ксантгидролового реактива, нагревают 5 мин на кипящей водяной бане, охлаждают 5 мин в холодной воде и выдерживают 15—20 мин при комнатной температуре. Появляется окрашивание от розовых до малиновых тонов. Окрашенный раствор помещают в кювету толщиной 1 см и определяют оптическую плотность при 528—532 нм на спектрофотометре СФ-4А на фоне контроля. Контролем служит элюат с чистого сорбента. Калибровочный график строят по ланатозиду С (целаниду), процентное содержание ланатозида в абсолютно сухом сырье рассчитывается по формуле

0,05аV1*10

X= ----------------------

V2 * m *100000

где а — количество вещества, найденное по калибровочному графику; Vj — объем экстракта, мл (пикнометр); V3 — объем экстракта, нанесенного на пластинку, мл; т — масса навески абсолютно сухого сырья, г; 1,05 — поправочный коэффициент.

Подготовка хроматографических пластинок.

4 г талька помещают в колбу на 25 мл, приливают 7 мл 95%-ного этилового спирта и 1 мл смеси формамид — ацетон (3:7). Смесь взбалтывают 30—40 с и выливают на пластинку, равномерно распределяя по всей площади. Пластинку высушивают на воздухе 20—25 мин и 10 мин в сушильном шкафу при t ч= 50 — 60 °С. Для хроматографии необходимы только свежеприготовленные пластинки.

Подготовка камеры для хроматографирования.