Электронный учебно-методический комплекс по учебной дисциплине Прикладные аспекты иммунологии (стр. 10 )

Иммуноанализ с использованием флуоресцентной метки

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Впервые данная реакция иммунофлуоресценции была предложена Coombs в 1942 г. Метод основан на определении антигенов в биологическом материале, мазках крови и др. с использованием моноклональных антител или антисывороток, меченных флуоресцентной меткой (прямая РИФ). Для удешевления метода первые (диагностические) антитела можно определять универсальным реагентом, меченной флуорохромами антииммуноглобулиновой сывороткой (непрямая РИФ). Существует множество модификаций РИФ для определения антител к инфекционным антигенам в сыворотке крови.

Основные преимущества РИФ: экономичность, широкий спектр наборов возможно использование как поликлональных, так и моноклональных антител, меченных флюоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ). Для снижения неспецифического свечения фона препараты обрабатывают бычьим сывороточным альбумином (БСА), меченным родамином или синькой Эванса.

Как правило РИФ применяется для быстрого обнаружения патогена в клиническом материале. Из биологического материала готовят мазок на предметном стекле, техника не отличается от таковой для обычной микроскопии. Препарат фиксируют метанолом, этанолом, ацетоном или другим растворителем. Поверхность фиксированного мазка обрабатывают меченными ФИТЦ антисыворотками или моноклональными антителами (в случае использования варианта непрямой РИФ препарат сперва обрабатывают поликлональной сывороткой против инфекционного антигена, после чего мечеными антивидовыми антителами к иммуноглобулинам, содержащимся в поликлональной сыворотке). Анализ с использованием РИФ является гетерогенным методом, поэтому один этап отделяется от другого промывкой.

Учет результатов данной реакции заключается в микроскопировании препаратов с использованием люминесцентного микроскопа, оптическая система которого имеет набор светофильтров, которые обеспечивают освещение препарата светом с заданной длинной волны. Субъективность данного метода заключается в том, что исследователь сам оценивает характер свечения, размер, форму объектов, их расположение и т. д.

При постановке реакции иммунофлуоресценции для обнаружения антител в биологическом материале, готовят препараты из эталонного штамма возбудителя. Исследуемой сывороткой обрабатывают мазок. При условии что в ней присутствуют определяемые антитела, они будут взаимодействовать с антигенами бактериальных клеток. После промывки препарата буферным раствором несвязавшиеся антитела будут удалены. При последующем добавлении меченой антисывороткой против антител человека, в случае положительного результата реакции, при наблюдении за мазком в люминесцентный микроскоп будет наблюдаться специфическое свечение клеток выбранной культуры (рисунок 11).

а - прямая иммунофлюоресценция: антитела к поверхностным антигенам, меченные флюорохромной меткой; б — непрямая иммунофлюоресценция: первоначально с антигенами связываются специфические иммуноглобулины, затем с первыми антителами связываются антивидовые иммуноглобулины, меченные флюорохромом; в - непрямая иммунофлюоресценция, оба иммуноглобулина мечены флюорохромом.

Рисунок 11 - Схема реакций иммунофлюоресценции.

Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением

Эта одна из разновидностей ФИА, принцип которой основан на иммобилизации одного из компонентов иммунной реакции на твердой фазе и использовании технологии «сэндвича», т. е. двойного распознавания, подобно вышеописанному методу ИРМА и технологии тИФА. Тем не менее, важным отличием данного метода является использование в качестве метки хелатированных комплексных соединений лантаноидов (редкоземельных элементов самария, европия, диспрозия и тербия). Достоинствами ФИА ВР являются высокая чувствительность, техника постановки эксперимента, сходная с ИФА, а также возможность значительного усиления полезного сигнала. Фуоресцентная метка данного типа способна к флулресценции неизмеримо дольше и сильнее, чем флуоресценция фона. Стоит отметить, способность метки к восстановлению свечения, что ведет к аккумуляции (усилению) полезного сигнала. Описанная система реализуется фирмой PerkinElmer, США, и имеет название Delfia, обладает высокой чувствительностью - более 10-17 М при количественном определении антигенов.

Метод проточной цитофлуориметрии

Метод проточной цитофлуориметрии позволяет анализировать клетки (бактерии, дрожжи, одноклеточные водоросли, клетки растений и животных), а также другие субклеточные структуры, к примеру изолированные ядра, хромосомы и т. д. Кроме того, в настоящее время развиваются специализированные методы анализа растворимых молекул, основанные на применении полимерных микросфер с конъюгированными моноклональными антителами.

Упрощенный вид работы проточного флюориметра представлен на рисунке:

1.  Взвесь клеток из пробирки с культурой забирается специальной иглой (1); затем клетки при помощи узкой струи впрыскиваются в центр ламинарного потока жидкости, которая представляет собой изотонический буферный раствор (2).

2.  Подача проточной жидкости из соответствующего резервуара и образца из пробирки осуществляется за счет подачи избыточного давления (3);

3.  Поток буферного раствора с клетками проходит через проточную ячейку (4), в этом месте происходит изучение оптических свойств соответствующих клеток;

После анализа свойств клеток в проточной ячейке поток смеси буферного раствора и клеток собирается в слив (5).

Как уже было сказано, измерение оптических свойств клеток проиходит в проточной ячейке, которая является ключевым элементом цитофлуориметра. Ламинарный поток буферного раствора протекает по узкому каналу в кювете из оптически подходящего прозрачного материала. В одной из частей канала, как правило в его центре сфокусирован лазерный луч, где клетки поочередно в потоке пересекают это место (рис. Б). Во время пересечения клеткой данного участка флуоресценция, а также рассеянный ею свет лазера регистрируются соответствующей оптической системой данного прибора.

Рисунок 12 - Принципиальная схема устройства проточной системы цитофлуориметра.

Оптическая система данного цитофлуориметра состоит из одного или несколько лазерных источника света (монохроматических) и системы для детекции сигнала. При пересечении клетками лазерного луча происходят следующие явления:

1) часть монохроматического света рассеивается под действием клетки;

2) часть энергии электромагнитного излучения поглощается и преобразуется в тепло, при протекании фотохимических процессов, либо вновь испускается в виде электромагнитного излучения (флуоресценция), однако, как правило, с меньшей энергией кванта;

3) часть электромагнитного излучения проходит без преобразования, не взаимодействуя с клеткой.

При анализе свойств отдельных клеток используются процессы 1) и 2), при этом в последнем случае исследуется флуоресценция.

Явление флуоресценции клетки может происходить как за счет эндогенных химических соединений (автофлуоресценция), так и при использовании специальных экзогенных соединений. Используются красители, которые специфически взаимодействуют с теми или иными частями и структурами клеток (кпримеру, пропидиум йодид, взаимодействует с ДНК) или конъюгаты красителей, используемых в качестве метки с моноклональными иммуноглобулинами, специфичными к соответствующим цитоплазматическим и мембранным антигенам клетки. Техника с использованием иммуноглобулинов к мембранным антигенам представляет собой наиболее распространенный подход в данном методе проточной цитофлуориметрии.

Рисунок 13 - Принципиальная схема типичной проточной ячейки (А); на рисунке показаны (Б) место, в котором клетка в потоке буферного раствора пересекает сфокусированный лазерный луч, (В) поперечный срез ламинарного потока.

Рисунок 14 - Схема цитофлуориметрии.

В самом простом случае, при применении только одного красителя, количественная оценка флуоресценции свидетельствует о числе сайтов связывания соответствующей метки с клеткой: при использовании ДНК-специфичного красителя – о концентрации ДНК в клетке, при использовании антител – об уровне экспрессии соответствующих антигенов в цитоплазме либо на поверхности клетки и т. п.

Рисунок 15 - Принцип анализа данных об интенсивности флуоресценции объектов при использовании одного вида красителя: увеличение интенсивности флуоресценции предполагает увеличение количества сайтов связывания метки с клеткой

Одновременное введение нескольких видов красителя позволяет определять популяции клеток с соответственным сочетанием изучаемых признаков (рисунок 16). Переходя к практике, следует отметить, что такой подход является очень существенным при анализе содержания в крови различных популяций лейкоцитов, каждая из которых, как известно, отличается уникальным составом поверхностных антигенов – кластеров дифференциации. Смесь антител с коньюгированными красителями при этом вводится в суспензию клеток одновременно, однако каждая клетка взаимодействует только с теми антителами, которые специфичны к экспрессируемым ею поверхностным антигенам.

Рисунок 16 - Принцип анализа данных о флуоресценции клеток при использовании нескольких видов красителей в качестве метки: сравнение интенсивности сигнала при использовании разных видов детекторов позволяет выявить в образце различные популяции клеток с соответствующим сочетанием изучаемых признаков.

Методы иммунохимического анализа с использованием ферментной метки

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ, как и другие тест-системы иммуноанализа, основан на реакции специфического взаимодействия антигенов и антител. Реакция образования иммунных комплексов является обратимой и соответственно носит равновесный характер, характеризуется сродством или аффинностью компонентов, зависит от их концентрации а также других условий взаимодействия. Для определения количества иммунных комплексов возможно прямое определение их концентрации, либо исследование оставшихся свободными сайтов специфического взаимодействия. Вторая стадия любого метода ИФА представлена формированием взаимодействия меченного ферментом коньюгата со свободными центрами связывания или специфическим комплексом. И как следует из названия, заключительной обязательной реакцией в ИФА является преобразование субстрата в продукт под действием ферментной метки, данный продукт представляет из себя соответствующий сигнал, который может измеряться каким-либо физико-химическим методом (флуориметрическим, спектрофотометрическим и т. д.).