Электронный учебно-методический комплекс по учебной дисциплине Прикладные аспекты иммунологии (стр. 11 )

В зависимости от принципа построения тест-систем выделяют неконкурентный и конкурентный ИФА.

В том случае, если на первой стадии в инкубационной смеси присутствует только определяемый компонент: антитело или антиген, то такой метод носит название неконкурентный. Как правило, такой принцип используется при анализе высокомолекулярных соединений.

В случае, когда на первом этапе анализа в инкубационной среде одновременно присутствуют исследуемое соединение и его модифицированный аналог (коньюгированное с ферментом либо иммобилизованное на твердой фазе анализируемое соединение), конкурирующие за специфические сайты связывания, то метод относят к конкурентным. Как правило, такой подход используется при анализе низкомолекулярных соединений.

Выделяют также гетерогенный и гомогенный ИФА. Из названия следует, что в первом случае все процессы идут при участии поверхности раздела фаз, на твердой фазе, во втором – в свободном объеме.

Следует также отметить, что количественный анализ, с использованием стандартов с заданными концентрациями аналитов, градуировочные графики, также имеют отличия в зависимости от типа ИФА, о чем будет сказано ниже.

Гетерогенный метод иммуноферментного анализа

Гетерогенный ИФА включает методы анализа, которые проводятся в двухфазной системе, причем данное разделение на отдельные фазы может происходить на любой из стадии анализа (тем не менее, первый этап имеет определяющее значение). Если изначально антиген или антитело используют в сорбированном виде на нерастворимом носителе, в иммобилизованном состоянии, за счет чего формирование специфического иммунного комплекса проходит именно на твердой фазе, то метод принято относить к твердофазным.

Наибольшее распространение в медицинской и лабораторной практике получил метод гетерогенного твердофазного ИФА (ELISA = enzyme linked immunosorbent assay). Для построения таких тест-систем обычно применяют 96-луночные полистирольные планшеты, как носитель иммобилизованного компонента, поскольку на полистироле можно легко адсорбировать белковые молекулы, в том числе антитела, а с помощью специфической обработки (коньюгация с молекулами БСА, овальбумина) и различные антигены.

В случае построения тест-системы ИФА для поиска высокомолекулярного антигена (рисунок 17), такую диагностическую систему разрабатывают по принципу «сэндвича» (двухцентровый ИФА). Другими словами - для анализа искомого антигена, его связывания и детекции применяют пару различных антител к разным неинтерферирующим антигенным детерминантам.

Первые антитела иммобилизуют на поверхности стенок лунок. Иммобилизация может идти как непосредственно путем адсорбции на полистироле, так и при использовании антивидовых антител, авидин\стрептавидин-биотиновых систем, белка А стаффилокока и т. д. Исследуемый биологический материал вносят в лунку, далее инкубируют и антиген, взаимодействуя с антителами с образованием иммунного комплекса, фиксируется на ней. Лунки тщательно отмывают промывочным буферным раствором для того, чтобы удалить неспецифическое связывание различных компонентов. После чего вносят вторые (детектирующие) иммуноглобулины против второй антигенной детерминанты искомого антигена, меченные ферментом. В качестве такой метки, как правило, используют пероксидазу хрена. После периода инкубации содержимое сливают, а лунку снова промывают, для удаления несвязавшихся меченых антител. На последнем этапе в лунки добавляют хромогенный субстрат (например, тетраметилбензидин или орто-фенилендиамин). Ферментативное преобразование субстрата приводит к появлению окрашенных продуктов такой реакции. Таким образом, в случае качественного анализа, изменение окраски содержимого лунки и будет сигнализировать о положительном результате реакции. Кроме того, интенсивность окрашивания, либо оптическая плотность, характеризует количество аналита, антигена (антител) в образце. Измерение оптической плотности раствора обычно проводят на соответствующем ИФА-ридере (планшетном фотометре). Следует заметить, что исходя из представленной схемы, чем больше аналита в исследуемом образце, тем большее количество фермента закрепиться на поверхности твердой фазы и тем интенсивнее будет окрашивание, как результат увеличения скорости ферментативной реакции.

Рисунок 17 - Схема твердофазного ИФА для определения антигена.

Следовательно, градуировочный график таких тест-систем представляет из себя прямопропорциональную зависимость между количеством аналита в пробе и оптической плотностью. В качестве примера таких тест-систем отечественного производства следует привести ИФА наборы для определения белковых гормонов: тиреотропина, фоликулстимулирующего, лютеинизирующего гормонов, пролактина, тиреоглобулина, онкомаркера ПСА и т. д.

При создании тест-систем (рисунок 18) используются также полистирольные планшеты, на поверхности которых заранее с помощью тех или иных методов иммобилизуется (адсорбируется) антиген. Для исключения неспецифического связывания иммуноглобулинов с полистиролом, при создании любых твердофазных тест-систем, оставшаяся свободной поверхность лунки блокируется (бычий сывороточный альбумин, белки молока, овальбумин).

Рисунок 18 - Схема твердофазного ИФА для анализа антител

Анализируемая биологическая жидкость вносится в лунку планшета. Далее гомологичные антигену иммуноглобулины прикрепляются к иммобилизованному на твердой фазе антигену. Не сорбировавшиеся антитела удаляют промыванием буферным раствором. На следующей стадии в лунки вносят антивидовые антитела, т. е. против иммуноглобулинов определенного класса (антител) человека, коньюгированные ферментом (используя антивидовые антитела против иммуноглобулинов различных классов человека, можно судить о характере иммунного ответа). Если в исследуемой биологической жидкости присутствовали искомые иммуноглобулины, то их молекулы на данном этапе выступят в роли антигенов, которыя представляют собой мишень для взаимодействия с мечеными антивидовыми антителами. Использование после промывки хромогенного субстрата даст качественный и количественный ответ на основании развивающегося окрашивания в лунках.

Прямой конкурентный твердофазный ИФА, как уже упоминалось, используется для анализа низкомолекулярных антигенов и может быть сконструирован по следующей схеме (рисунок 19). К сорбированным на носителе антителам добавляют биологическую жидкость, содержащую анализируемый низкомолекулярный антиген и заданное количество антигена, коньюгированного с ферментом. После инкубации лунки отмывают от несвязанного меченого и свободного антигена и анализируют ферментативную активность на твердой фазе.

Рисунок 19 - Схема прямого конкурентного твердофазного ИФА

Следует заметить, что исходя из представленной схемы, чем больше аналита в исследуемом образце, тем меньшее количество фермента закрепиться на поверхности твердой фазы, как результат конкуренции, и тем менее интенсивно будет окрашивание, как результат снижения скорости ферментативной реакции. Следовательно, градуировочный график таких тест-систем представляет из себя опропорциональную зависимость между количеством аналита в пробе и оптической плотностью. В качестве примера таких тест-систем отечественного производства следует привести ИФА наборы для определения стероидных и тиреоидных гормонов: альдостерона, кортизола, прогестерона, эстрадиола, Т3, Т4 и т. д.

В непрямом конкурентном варианте ИФА применяют меченные ферментом антивидовые иммуноглобулины и сорбированный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель (БСА, овальбумин, белки молока).
Непрямой метод с использованием меченых антивидовых иммуноглобулинов является одним из наиболее распространенных схем тест-систем. На поверхности полистирольного планшета иммобилизуют конъюгат антиген-белок, далее вносят раствор, содержащий анализируемые молекулы и фиксированное количество немеченых моноклональных антител, инкубируют и после промывки и удаления несвязанных компонентов вносят добавляют фиксированное количество меченых ферментом антивидовых антител. После взаимодействия и промывки носителя анализируют ферментативную активность связавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, таким образом, величина сигнала, значение оптической плотности, находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого аналита.

Рисунок 20 - Схема непрямого конкурентного твердофазного ИФА

Использование универсального реагента — коньюгата антивидовых антител — даёт возможность определять иммуноглобулины к разным молекулам. Более того, исследуемый образец и меченый реагент используются в системе на разных стадиях процесса, что нивелирует воздействие различных эффекторов, которые содержатся в образце, на каталитическую активность ферментной метки. Тем не менее, описанная схема анализа усложняет его использование из-за появления дополнительных стадий.

Гомогенные методы ИФА

К гомогенным иммунохимическим методам анализа относятся методы, проводимые в однофазной системе, где отсутствует стадия механического разделения образовавшихся иммунных комплексов. Все методы такого типа относятся к конкурентным и в своей основе имеют одновременное взаимодействие с моноклональными антителами исследуемого и идентичного ему меченого антигенов. После периода инкубации в растворе образуется соответствующий иммунохимический комплекс. Измерение активности фермента позволяет установить концентрацию анализируемого антигена, поскольку такая активность пропорциональна концентрации связанного или свободного меченого лиганда.

Одним из методов, получивших широкое распространение является EMIT-анализ (enzyme monitored immunoassay technique), который основан на исследовании активности ферментна в конъюгате фермент-антиген в условиях образования комплекса с антителами. Как правило такое взаимодействие приводит к изменению активности из-за конформационных изменений в молекуле фермента либо пространственном исключении проникновения молекулы субстрата к каталитическому сайту фермента. Преимуществами гомогенных методов исследования является сокращение стадий и времени на проведения анализа, недостатками – сниженная чувствительность и подверженность влиянию состава анализируемого материала на результаты анализа.