Электронный учебно-методический комплекс по учебной дисциплине Прикладные аспекты иммунологии (стр. 7 )

Следует учитывать, что нестабилизированные наночастицы серебра в растворах подвергаются быстрому окислению и легко агрегируют. Поэтому ряд работ посвящен изучению взаимодействия коллоидного серебра с различными средами и разработке методов стабилизации таких частиц.

Углеродные наночастицы

Углеродные наночастицы разнообразны по структуре: наносажа, графен, одностенные и многостенные нанотрубки, фуллерены, аморфный углерод. В 1993 г. van Аmerongen А. и соавторы впервые использовали наночастицы аморфного углерода как метки для иммунохроматографических тест-систем. Данный подход был успешно применен и в ряде последующих работ, преимущественно – той же научной группы. Основные достоинства углеродного маркера – высокая стабильность и контрастность окрашивания на мембране (черные частицы на белом фоне). Высокий коэффициент экстинкции наночастиц обеспечивает крайне низкий предел их обнаружения, который для приборной регистрации достигает пикомолярных концентраций (2 пМ). Кроме оптических свойств, для регистрации углеродных наночастиц используют и их электрические характеристики, разрабатывая методы анализа с амперометрической и вольамперометрической детекцией.

Магнитные наночастицы

Эффективным аналитическим реагентом являются растворы парамагнитных частиц – коллоидные препараты кластеров металлов или их оксидов, способные перемещаться в магнитном поле. Наиболее широкое распространение в аналитических системах получили ферромагнетики – смеси оксидов железа Fe2O3 и FeO. Магнитные свойства наночастиц могут быть использованы как для концентрирования аналитических реагентов, так и для выявления специфических комплексов.

Применение магнитных наночастиц в иммунохроматографии описано в ряде работ. Маркер может детектироваться как по отклику (намагничивание) на внешнее магнитное поле, так и по окраске (ферромагнитные частицы – интенсивного коричневого цвета). Магнитные детекторы выявляют маркеры во всем объеме мембраны, без каких бы то ни было эффектов экранирования, характерных для оптических методов.

Преобразующие флуорофоры

Преобразующие флуорофоры (up-converting phosphors (UCP)) представляют собой комбинацию иона-донора и иона-акцептора энергии в одной субмикронной кристаллической структуре. При инфракрасном облучении ион-донор высвобождает энергию, квант энергии переходит на акцептор, который в свою очередь испускает фотон в видимой или ближней инфракрасной области в зависимости от состава кристалла. При детекции маркера эти испускаемые фотоны регистрируются.

При получении преобразующих флуорофоров в качестве донора широко применяются кристаллы итрий-фторида натрия (NaYF4) с гексагональной кристаллической решеткой. Роль акцептора в большинстве случаев играют комплексы трехвалентных лантанидов – самарий, иттербий и др. Благодаря эмиссии в ближней инфракрасной области тест-системы на основе лантанидных комплексов характеризуются низким фоновым сигналом, что позволяет с их помощью тестировать различные сложные матриксы, такие как кровь, слюна, экстракты пищевых продуктов.

Инфракрасные маркеры

В качестве инфракрасных маркеров в тест-системах используются композитные материалы Y2O3:Nd3+ или YF3: Er3+. При облучении светом в видимом диапазоне (500-900 нм) эти соединения флуоресцируют в ближней инфракрасной области спектра (900-1100 нм).

Как и для преобразующих флуорофоров, для данных соединений характерно высокое соотношение сигнал : шум, обеспечиваемое благодаря низкому собственному свечению носителя. Главный недостаток инфракрасных маркеров на основе лантанидов – нестабильность из-за тушения флуоресценции, которое можно снизить введением меток в латексные, полимерные или кремниевые наночастицы.

Квантовые точки

Полупроводниковые квантовые точки (КвТ) представляют собой нанокристаллы бинарных соединений из элементов II–VI и III–V групп Периодической системы Менделеева, линейные размеры которых по всем трем направлениям меньше радиуса экситона Бора данного соединения (1–10 нм). Например, для CdSe радиус экситона Бора составляет 6 нм, и размер КвТ, соответственно, варьирует от 1 до 6 нм. Малые размеры полупроводниковых нанокристаллов приводят к тому, что образующаяся при облучении пара электрон – дырка (экситон) перемещается внутри кристалла и испускает фотон: частица флуоресцирует. Квантовые точки характеризуются высокой внутренней энергией носителей заряда, а также зависимостью оптических параметров от размеров. Частицы такого же состава, но больших (по сравнению с радиусом экситона Бора) размеров эти свойства утрачивают.

Как правило, в состав квантовых точек, кроме ядра, входят и дополнительные компоненты – металлическая оболочка и полимерное покрытие (рисунок 6 ). Ядро, формирующееся из таких соединений, как CdS, CdSe, InP и др., обеспечивает флуоресцентные свойства КвТ, причем спектры эмиссии в существенной степени зависят от состава ядра (рисунок 6). Металлическая оболочка (ZnS, ZnSe и др.) препятствует неизлучательному переходу энергии, стабилизирует наночастицу и усиливает флуоресценцию. Кроме того, металлическая оболочка предотвращает фото-окислительную деградацию ядра, концентрирует свободные электроны в объеме. Для большей стабильности, водорастворимости квантовых точек и исключения негативного влияния металлических поверхностей на биомолекулы КвТ покрывают полимерными оболочками. В состав таких покрытий вводят амино-, карбокси - или другие функциональные группы, обеспечивающие возможность конъюгирования КвТ с биомолекулами. Модификация поверхности КвТ полимерами и биомолекулами практически не влияет на их оптические свойства.

Рисунок 6 - Схематическое строение квантовой точки.

КвТ как аналитические маркеры могут регистрироваться по флуоресценции (прямая детекция) или электрохимическими способами (непрямая детекция). КвТ характеризуются широким спектром поглощения, возбуждением в широком диапазоне длин волн, узким симметричным пиком эмиссии (полуширина 20–30 нм для препаратов, гомогенных по размерам). Варьируя состав и размер КвТ, можно добиться любой длины волны испускаемого света. В отличие от органических красителей, которые подвергаются быстрому фотовыцветанию, КвТ могут быть использованы в нескольких повторных циклах возбуждение–испускание. Квантовые точки характеризуются высоким квантовым выходом флуоресценции как в органических, так и в водных средах (0,5–0,9), тогда как для органических флуорофоров квантовый выход флуоресценции в водных растворах существенно ниже (0,2–0,6).

Липосомы

Липосомы представляют собой структуры из амфифильных молекул, формирующие в результате самосборки оболочку и внутреннюю полость. Во внутреннем слое оболочки находятся гидрофобные части молекул, образующих липосому, тогда как гидрофильные части выходят на ее поверхность (наружную либо внутреннюю). Для аналитических целей используются липосомы размером от 50 до 800 нм. В аналитических системах липосомы используются для концентрирования маркера и его присоединения к селективному реагенту (обычно – антителу, иммобилизуемому на внешней поверхности липосомы). Маркерами, инкапсулированными внутри липосомы, могут быть цветные красители, флуоресцентные красители, ферменты, электроактивные компоненты и др. Включение в липосому значительного числа молекул маркера позволяет снизить предел обнаружения на 2-3 порядка по сравнению с непосредственным мечением иммунных комплексов.

Главным недостатком липосом является низкая стабильность при хранении и работе в сложных матриксах. Липосомы легко подвергаются лизису при добавлении поверхностно-активных веществ и разрушаются при использовании стандартных протоколов высушивания.

Латексные наночастицы

Латексные наночастицы представляют собой частицы из полистирола, полиметилметакрилата и других полимерных материалов диаметром от 50 до 500 нм (т. е. находятся у верхней границы нанодиапазона, а порой – и за ее пределами). Существуют методы синтеза цельных и полых латексных частиц. Основная область аналитического использования латексов – агглютинация.

В состав латексных частиц могут входить маркеры разных типов – красители, флуорофоры, магнитные наночастицы и др. При этом возможна как иммобилизация маркеров на поверхности частицы, так и их включение в объем частицы при синтезе и диспергировании. Имеется ряд коммерчески доступных латекстных частиц, меченных флуорофорами. Некоторые красители и флуорофоры сложно ковалентно присоединить к антителам или антигенам, так как у них отсутствуют активные группы, а модификация ухудшает флуоресценцию. Применение латексов решает эту проблему, позволяя включить маркер в частицу в немодифицированном виде. Латексы, как и липосомы, могут концентрировать большое число маркеров, амплифицируя аналитический сигнал. Еще одним преимуществом является возможность сочетания в латексной частице маркеров разных цветов (что позволяет одновременно идентифицировать до сотни соединений) или объединения в ее составе маркера и средства разделения детектируемых комплексов (например, флуорофоров и магнитных частиц). Наконец, важное достоинство латексных частиц – доступность и низкая стоимость.

Ультрадисперсные частицы диоксида кремния

Кремниевые наночастицы могут детектироваться за счет собственных флуоресцентных свойств (зависящих от размера) или инкапсулированных реагентов. Инкапсуляция разнообразных маркеров позволяет детектировать получаемые комплексы по окраске, флуоресценции или электропроводности. Концентрирование красителей в кремниевых наночастицах (как и для рассмотренных выше липосом и латексов) обеспечивает низкий предел обнаружения аналита. Инкапсулированные красители характеризуются высокой фотостабильностью, устойчивостью к компонентам среды. Стабильна и собственная флуоресценция наночастиц диоксида кремния.

4. Техника биоконьюгации и способы введения меток в макромолекулы.

Для того чтобы гаптен обладал иммуногенными свойствами, либо был зафиксирован с помощью физико-химисеких способов детекции, необходимо получить конъюгат гаптена с высокомолекулярным носителем либо меткой. В качестве носителей обычно используют бычий сывороточный альбумин (БСА), альбумин сыворотки человека, овальбумин, тироглобулин и синтетические пептиды типа полилизина. Особых преимуществ у какого-либо носителя не отмечено и поэтому чаще всего им является наиболее доступный белок — БСА. В качестве меток используются различные вышеописанные частицы.

Известно несколько способов нахождения количества молекул гаптена, пришитых к носителю:

•  спектрофотометрический способ

•  электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия или по аминокислотному гидролизу конъюгата
титрование свободных аминогрупп в исходном белке и конъюгате

•  радиоизотопный метода, в котором используют меченный радиоактивным изотопом гаптен.

Получение конъюгатов-иосителей с гаптенами, содержащими карбоксильную группу.