Электронный учебно-методический комплекс по учебной дисциплине Прикладные аспекты иммунологии (стр. 14 )

Иммуномагнитная сепарация.

Необходимым условием проведения иммуномагнитной сепарации клеток-мишеней из суспензии является наличие:

иммуномагниточувствительных микросфер (ИММС);

- моноклональных антител (МКАТ);

- магнитного сепаратора;

- лабораторного оборудования, посуды и растворов.

Магниточувствительные микросферы

Магниточувствительные микросферы (ММС) являются суперпарамагнитными монодисперсными полимерными частицами. Они содержат в своей структуре равномерно распределенный по объему магнитный материал, который под действием внешнего магнитного поля приобретает собственый магнитный момент (намагничивается до насыщения). Полимер тонким слоем покрывает частицы магнетита и определяет поверхностные характеристики микросфер (форму, размер). Микросферы являются твердофазными носителями МКАТ. Они конъюгированы с панелью моно - поликлональных антител, обладающих специфической иммунологической восприимчивостью к определенным клеткам в зависимости от наличия на их поверхности типа кластеров дифференцировки — CD. Это дает возможность образовывать комплексы микросферы — клетка (КМК) посредством связи антиген-антитело, а наличие включения в них магнетита позволяет быстро и избирательно выделять КМК с помощью магнитного сепаратора.

Различают:

Первичнопокрытые ММС (ПММС). Готовы к использованию и добавляются непосредственно к клеточной суспензии. Они могут быть покрыты первичными МКАТ, которые прямо посажены на поверхность микросферы, или через вторичные антитела, специфические к первичным.

Вторичнопокрытые ММС (ВММС). Различные мышиные, крысиные или кроличьи поликлональные или моноклональные антитела, которые могут быть использованы в клеточной сепарации после инкубации их с ВММС.

Непокрытые активированные ММС (АММС). На АММС перед экспериментом могут быть посажены специфические поли- или моноклональные антитела и лиганды.

Типы иммуномагнитной сепарации.

Прямой метод — при котором магнитные микросферы, первично покрытые МКАТ, добавляют непосредственно к суспензии клеток. В процессе инкубации образуются комплексы ИММС с клетками-мишенями. Эти комплексы могут быть удалены из суспензии с помощью магнитного сепаратора.

Непрямой метод — при этом методе клетки-мишени метятся первичными MKT, которые добавляют к суспензии клеток. После периода инкубации свободные несвязавшиеся МКАТ отмывают центрифугированием и только затем к этой суспензии клеток добавляют магнитные микросферы, покрытые вторичными моно - или поликлональными антителами.

В процессе инкубации ВММС связываются с клетками, меченными первичными МКАТ. Эти комплексы также могут быть удалены с помощью магнитного сепаратора. Таким образом, прямой метод более экономичен по использованию количества МКАТ и времени для проведения полной сепарации, однако непрямой метод более эффективен при одновременном выделении нескольких клеток-мишеней из суспензии.

Позитивная сепарация — выделение и концентрация интересующих клеток из исследуемого объекта. Она используется обычно в прямом методе и позволяет выделять клетки с высокой степенью очистки.

Негативная сепарация — метод, с помощью которого клеточная популяция очищается путем удаления всех других типов клеток из исследуемого материала. Негативная изоляция может быть проведена как прямым, так и непрямым методом.

Технология магнитной сепарации для Т-клеточной иммунотерапии.

В настоящее время становятся достаточно актуальными исследования, посвященные возможности использования аутологичных и геннномодифицированных Т-клеток в комплексной терапии ряда опухолей и злокачественно протекающих инфекций. По данным зарубежных авторов, приведенным в таблице, Т-клеточная иммунотерапия доказала свою эффективность в ряде тяжелых иммунологических заболеваний.

Для выделения специфичной Т-клеточной популяции и ее пролиферации традиционно использовали достаточно длительную процедуру концентрации и культивирования Т-клеток в сочетании с антигенной стимуляцией. Благодаря развитию технологии иммуномагнитной сепарации сегодня появился новый методологический подход к получению Т-клеток с целью их пролиферации и генетической модификации для Т-клеточной иммунотерапии. В системе in vivo распознавание антигена и активация Т-клетки происходит посредством поверхностных рецепторов CD3 и CD28.

Метод иммуноафинной хроматографии.

Данный метод используется для выделения из биологических жидкостей иммуноглобулинов, антигенов и основан на реакции образования комплексов антиген-антитело. Поскольку данная реакция является обратимой данное взаимодействие можно использовать для очистки макромолекул.

Пропускают белковый раствор, содержащий исследуемый антиген. Большинство макромолекул проходит через частицы носителя не задерживаясь, в то время как между антителами, иммобилизованными на носителе, и антигеном, содержащимся в растворе, образуется иммунный комплекс. После отмывки носителя от не связавшихся белков иммунный комплекс разрушают, пропуская через носитель растворы с низкими (pH 2,0 – pH 4,0) или высокими (pH 11,0 – pH 12,0) значениями рН, либо растворы с высокой ионной силой (2М NaCl), либо растворы, содержащие хаотропные соединения (KSCN). При этом исследуемый белок элюируют с носителя, его собирают и переводят в оптимальный для хранения данного белка буфер.

Весь процесс можно представить в виде следующих стадий:

1.  Взаимодействие антиген-антитело, образование иммунокомплекса;

2.  Промывка нерастворимого носителя от неспецифического связывания;

3.  Выделение искомого антигена, путем разрушения иммунных комплексов.

Рисунок 27 – Иммуноафинная хроматография на примере выделения микотоксина из биологической жидкости.

Иммуноприципитация.

Второй способ экстракции исследуемого белка из сложной смеси – иммунопреципитация, или экстракция в объеме. Иммунопреципитацию используют при работе с незначительными (нано - и микрограммы) количествами вещества. При этом объем аффинного носителя обычно не превышает сотен микролитров, а объем исследуемого образца – нескольких миллилитров. То есть, иммунопреципитацию используют в тех ситуациях, когда из-за малого количества исследуемого вещества оказывается технически сложным создать адекватную по размерам аффинную колонку.

Рисунок 28 – Иммуноприципитация микроколичеств антигена.

Приготовление нерастворимых сорбентов для иммуноафинной хроматографии.

Первым этапом данной работе является приготовление коньюгата: сорбент-белок. Одним из наиболее распространенных носителей, используемых в биохимии уже на протяжении нескольких десятилетий, является сефароза – специальным образом обработанные сферические гранулы агарозы. Известно несколько способов активации сефарозы, однако чаще других применяют метод активации сефарозы с использованием бромциана (BrCN). Преимуществом данного метода является простота, высокая устойчивость образующихся связей, стабильность сефарозы в довольно широком диапазоне рН (от 2,0 до 12,0). Относительная жесткость и крупные размеры частиц сефарозы позволяют использовать такие носители в колоночной хроматографии при достаточно высоких скоростях подачи растворов на колонку. Активацию сефарозы осуществляют в процессе инкубации раствора бромциана с водной суспензией сефарозы. Бромциан взаимодействует с гидроксильными группами сефарозы, в результате чего образуется имидокарбонат, содержащий электрофильный атом углерода. Помимо этого в ходе реакции образуется неактивный карбамат, не способный к реакции с нуклеофильными боковыми группами аминокислот. При взаимодействии имидокарбоната с нуклеофильными группами, прежде всего с e-аминогруппами лизина, происходит образование прочной ковалентной связи белка с активированной матрицей через остаток изомочевины или N-замещенного карбамата. Реакция активации матрицы бромцианом проходит только в щелочной среде с выделением бромистоводородной кислоты, для нейтрализации которой требуется постоянное добавление щелочи к реакционной смеси. Реакция бромциана с гидроксилами матрицы экзотермична, поэтому ее проводят на ледяной бане. Нужно заметить, что активными нуклеофилами, кроме e-аминогрупп лизина, являются также SH-группа цистеина, концевые аминогруппы белков и ОН-группа тирозина (по активности данные группы располагаются в следующем порядке: SH-, концевая NH2-, OH-группа тирозина). С другой стороны, тиоэфиры менее прочны, чем кислородные эфиры, а последние уступают по прочности амидным связям. Схематически данные реакции можно представить в виде следующей схемы (рисунок 28).

Рисунок 28 - Схема иммобилизации белка на BrCN-активированной сефарозе.

5. Инженерия антител.

Генно-инженерная технология революционизировала иммунологию, сформировав направление, получившее название "инженерия антител", целью которого является получение на основе генов иммуноглобулинов несуществующих в природе конструкций с заданными свойствами.

Методы генетической инженерии дают возможность эффективно менять как макро - так и микроструктуру получаемых искусственных антител.

Примером первого является изменение изотипа антитела путем использования генов, кодирующих соответствующую Fс-область.

Примером второго - точечные замены аминокислот путем направленного мутагенеза, приводящие к изменению эффекторных функций, если замена произведена в Fс-области, или к изменению сродства (как повышению, так и понижению) к антигену, когда меняются остатки в CDR-участках вариабельных доменов.

Следующим этапом развития гибридомной технологии после получения гибридом стало получение " квадром " - клеточных линий, получаемых в результате слияния двух гибридом, продуцирующих антитела разной специфичности. В результате удается создать клетки, секретирующие бифункциональные иммуноглобулины, имеющие в одной молекуле два разных по специфичности центра связывания антигена и обладающие таким образом сродством к двум различным антигенам. Все упомянутые выше антитела и их производные широко используются главным образом для целей диагностики и биотехнологии. Их применение для терапии и диагностики in situ ограничивается тем, что в основном с помощью гибридомной технологии удается получить молекулы мышиных иммуноглобулинов, которые вызывают у человека иммунный ответ, что приводит к их нейтрализации. Именно это обстоятельство инициировало поиск путей снижения иммуногенности мышиных моноклональных антител путем удаления отдельных фрагментов или замены их на аналогичные участки иммуноглобулинов человека.