Электронный учебно-методический комплекс по учебной дисциплине Прикладные аспекты иммунологии (стр. 13 )

По принципу построения таких тест систем можно выделить 2 формата: прямой ИХА и конкурентный метод ИХА.

В случае прямого (соответствует схеме «сэндвич») ИХА применяют конъюгат метка-антитело, нанесенный на соответствующую мембрану для конъюгата. На первой линии, где визуализируется результат иммобилизованы моноклональные антитела, специфические к данному аналиту, а на месте второй линии (контрольной)
- антивидовые иммуноглобулины, специфически взаимодействующие с первичным антителам, входящими в состав коньюгата. При внесении биологической жидкости, содержащей анализируемый антиген, на мембрану с конъюгатом метка-антитело происходит взаимодействие аналита с иммуноглобулином. После чего, образовавшийся иммунный комплекс под действием капиллярных сил попадает в тестовую зону, в которой он связывается со специфическими вторыми иммуноглобулинами, образуя «сэндвич» следующего состава: Ат-Аг-Ат-метка. Избыток
образовавшегося конъюгата продвигается далее и связывается с антивидовыми иммуноглобулинами на контрольной линии. В ходе вышеописанных процессов появление 2-х линий на тест-системе является положительным ответом на анализ. При условии отсутствия
антигена в образце конъюгат антитело-метка связывается с антивидовыми иммуноглобулинами только на линии контроля, визуализируется одна линия на тест-полоске, что свидетельствует о правильной работе данного продукта.

В качестве примеров использования метода прямого ИХА можно привести выявление высокомолекулярных частиц - вирусы, к примеру ВИЧ, различных белковых гормонов (например, хорионический гонадотропин в тест-полосках на беременность), антигены либо антитела против возбудителей инфекций (рисунок ).

В случае конкурентого метода ИХА анализ используемый для выявления низкомолекулярных веществ. Данный метод основан на конкурентном взаимодействии антигена и иммобилизованного конъюгата антиген-белок-носитель за фиксированное количество сайтов связывания специфических иммуноглобулинов, содержащихся в конъюгате антитело-метка. При появлении анализируемого образца, содержащего антиген, он взаимодействует с конъюгатом антитело-метка. Далее образовавшийся иммунокомплекс перемещается через тестовую зону, в этом месте сорбирован конъюгат антиген-белок-носитель. Иммунный комплекс не способен связаться с этим конъюгатом так как имеет стерические затруднения, поскольку низкомолекулярные вещества, как правило, имеют одну антигенную детерминанту а антитела, соответственно, имеют один сайт взаимодействия с антигеном, который на данный момент является связанным с аналитом. При дальнейшем передвижении иммунный комплекс взаимодействует с антивидовыми антителами, иммобилизованными на линии контроля. В результате проведения такого теста возможно отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне при одновременном наличии окраски в зоне контроля, что свидетельствует о том, что количество анализируемого вещества в биологическом образце превышает его заданное пороговое значение для данного вида теста. В случае отсутствия анализируемого антигена в биологической жидкости конъюгат антитело-метка взаимодействует с конъюгатом антиген-белок-носитель, сорбированным на тестовой линии. Непровзаимодействовавший конъюгат антитело-метка передвигается в зону контрольной линии и взаимодействует там с антивидовыми иммуноглобулинами. В результате -
визуализация двух окрашенных полосок (контрольной и тестовой) есть отрицательный результат анализа данного вида тест-системы.

В случае конкурентого метода ИХА анализ используемый для выявления низкомолекулярных веществ. Данный метод основан на конкурентном взаимодействии антигена и иммобилизованного конъюгата антиген-белок-носитель за фиксированное количество сайтов связывания специфических иммуноглобулинов, содержащихся в конъюгате антитело-метка. При появлении анализируемого образца, содержащего антиген, он взаимодействует с конъюгатом антитело-метка. Далее образовавшийся иммунокомплекс перемещается через тестовую зону, в этом месте сорбирован конъюгат антиген-белок-носитель. Иммунный комплекс не способен связаться с этим конъюгатом так как имеет стерические затруднения, поскольку низкомолекулярные вещества, как правило, имеют одну антигенную детерминанту а антитела, соответственно, имеют один сайт взаимодействия с антигеном, который на данный момент является связанным с аналитом. При дальнейшем передвижении иммунный комплекс взаимодействует с антивидовыми антителами, иммобилизованными на линии контроля.

Рисунок 23 - Принцип построения тест-систем на основе прямого метода иммунохроматографического анализа.

В результате проведения такого теста возможно отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне при одновременном наличии окраски в зоне контроля, что свидетельствует о том, что количество анализируемого вещества в биологическом образце превышает его заданное пороговое значение для данного вида теста. В случае отсутствия анализируемого антигена в биологической жидкости конъюгат антитело-метка взаимодействует с конъюгатом антиген-белок-носитель, сорбированным на тестовой линии. Непровзаимодействовавший конъюгат антитело-метка передвигается в зону контрольной линии и взаимодействует там с антивидовыми иммуноглобулинами. В результате - визуализация двух окрашенных полосок (контрольной и тестовой) есть отрицательный результат анализа данного вида тест-системы.

Конструкции, построенные по принципу конкурентного типа ИХА, применяются для анализа низкомолекулярных веществ, к примеру, метаболитов наркотических и психотропных веществ в моче и других биологических жидкостях.

Рисунок 24 - Принцип построения тест-систем на основе конкурентного метода иммунохроматографического анализа.

Преимуществом описанных методов анализа является быстрота и легкость их использования, возможность применения неприборных типов ИХА с оценкой результата анализа методом простой визуализации. В таких случаях не требуется применение никакого оборудования и исследование может быть проведено неспециалистом в домашних условиях. Однако по своей чувствительности ИХА тест-системы уступают другим описанным методам иммунного анализа, что привело к их использованию лишь в качестве ориентировочного анализа.

Иммуносенсоры

Иммуносенсорные устройства – это конструкции, состоят из датчика, содержащего иммобилизированный для специфического взаимодействия антиген или антитело, с которого сигнал о связывании лиганда преобразуется и передается на ЭВМ.

Преобразование и передача сигнала может осуществляться путем измерения оптических свойств, массы образовавшихся иммунных комплексов, электрохимических процессов и колориметрических процессов взаимодействия антиген-антитело. Принцип методов, основанных на иммуносенсорной технологии, заключается в изменении физико-химических свойств мембраны или другого носителя, связанного с антителами или антигенами. Уменьшение мембранного потенциала, изменение оптических или химических свойств среды, прилегающей к носителю, выявляются с помощью специального электрода или оптического устройства и выражаются в виде электрического сигнала. Среди данных устройств можно выделить два типа иммуносенсоров: непрямого и прямого типа. Непрямые иммуносенсоры для обнаружения связывания в своей основе используют меченные компоненты (хемолюминесценция, флуоресценция).

Рисунок 25 - Схема построения иммуносенсоров.

Иммуносенсоры прямого типа способны обнаруживать взаимодействие антиген-антитело посредством переноса электронов, поглощению или выделению газов, сопротивления, разности потенциалов, массы, изменению оптических свойств, температуры и т. д. Иммуносенсоры прямого типа можно использовать для мониторинга взаимодействия АТ-АГ в режиме реального времени.

На данный момент существует весьма небольшое количество коммерческих тест-систем такого типа, однако они считаются довольно перспективным направлением разработок иммуноанализа.

Иммуносигнатура.

Иммуносигнатура является относительно новым и весьма перспективным для использований в клинической практике направлением. Суть данного метода диагностики под названием иммуносигнатура состоит в отслеживании соответствующих иммунных реакций: каждое заболевание вызывает ответ иммунной системы, по продуктам данного ответа можно диагностировать заболевание и установить его тип. Для получения иммуносигнатуры капля биологической жидкости наносится на микрочип, на котором иммобилизованы 10 тыс. различных аминокислотных последовательностей (антитела либо антигена), реагирующих на находящиеся в крови клетки иммунной системы. Применение микрочипов позволяет выявить антитела, образованные в ответ на заданную последовательность аминокислот, и поставить диагноз на ранней стадии развития заболевания. 

Рисунок 26 - Схема проведения анализа иммуносигнатуры для диагностики различных заболеваний.

Приготовление микрочипов заключается в раскапывание рекомбинантных антигенов на поверхность предметного стекла активированного определенным образом. Объемы в данном случае составляют нанолитры, а вносимая масса антигена - десятки пикограмм. Каждое стекло имеет в своем составе 12 ячеек. В каждой ячейке может находится десятки (сотни) разнооьразных антигенов, в том числе и различные количества для построения калибровочного графика в нескольких повторностях. раскапывание сывороток пациентов (15 мкл);

Такого типа микрчипы применяются для установления наличия и исследования иммуноглобулинов класса Е, аутоантител против собственных антигенов при анализе системных аутоиммунных заболеваниях (системная красная волчанка, ревматоидный артрит и т. д.). в тоже время обратная методика (иммобилизация набора моноклональных иммуноглобулинов на стекле) применяется для выявления полисахаридов, белков, лекарственных препаратов, ядов и др. в составе биологических жидкостей, причем для анализа подходят не только гомогенные растворы, но и суспензии различных клеток.