Выделение и изучение углеводородокисляющих бактерий (стр. 2 )

Эмульгирование (солюбилизация) углеводородов с помощью ПАВ улучшает поступление этих гидрофобных субстратов из почвы и воды в микробные клетки и, соответственно их деградацию.

С функциональной точки зрения сложный процесс нефтедеструкции можно разделить на два последовательных процесса: обеспечение доступности гидрофобного субстрата для клетки и собственно окисление компонентов нефти. До того, как бактерии смогут расти на углеводородном субстрате, необходимо дерепрессировать гены алканокисляющей системы, также как и гены систем, контролирующих прикрепление к углеводородному субстрату и его поглощение [24]. Последнее часто сопряжено с продукцией биоПАВ, которые изменяют клеточную поверхность бактерий либо повышают гидрофобность клеточной стенки, растворимость и биодоступность гидрофобных субстратов за счет увеличения площади поверхности контакта нефтесодержащего вещества и микробных клеток.

Для нефтедеструкторов производство эмульгаторов – основной способ доступности нефти. Кроме того, присутствующая в среде нефть является индуктором систем синтеза и секреции ПАВ [2]. Показано, что при выращивании штамма Rhodococcus erythropolis на гидрофильных субстратах синтезируется преимущественно эмульгатор, а гидрофобных – вещества с поверхностно-активными свойствами [21].

Низкомолекулярные углеводороды (до С8) относительно высоко растворимы, поэтому попадают в клетки путем диффузии. Высокомолекулярные углеводороды проникают в клетки в виде микрокапель. Клеточные стенки нефтеокисляющих бактерий обладают гидрофобными свойствами, что обеспечивает контакт между микроорганизмом и нерастворимым субстратом.

Механизмы биодеградации алифатических углеводородов

Для разложения алканов требуется их активация молекулярным кислородом с помощью оксигеназ. Биодеградация алканов может протекать по моно-, ди - и внутритерминальным путям [10]. В большинстве случаев деградация алифатических углеводородов начинается с окисления концевой метильной группы в первичную спиртовую группу. Реакция протекает с участием монооксигеназы. Донором электронов для монооксигеназ служит рубредоксин – низкомолекулярный белок, активный центр которого содержит атом Fe2+/Fe3+, связанный с остатком цистеина. В свою очередь рубредоксин восстанавливается цитоплазматическим NADH-зависимым ферментом.

Первичный спирт образовавшийся из углеводорода, окисляется сначала до альдегида, а затем под действием НАД-зависимых дегидрогеназ до соответствующих жирных кислот, которые затем разлагаются путем β-окисления, либо используется клеткой в качестве строительного материала.

Помимо монооксигеназ у аэробных микроорганизмов в окислении алканов могут также участвовать диоксигеназы. Это так называемый путь Финнерти, в котором алканы окисляются до альдегидов через образование гидропероксидов, минуя стадию образования спиртов и кислородных радикалов, как это наблюдается при действии монооксигеназ. По этому механизму может осуществляться окисление н-алканов (С10 – С30) и алкенов (С12– С20) [10].

Известны сульфат - и нитратредуцирующие бактерии, способные медленно метаболизировать углеводороды в анаэробных условиях. Центральной стадией анаэробной деградации алканов, как и анаэробной деградации ароматических углеводородов, является карбоксилирование молекулы субстрата. При этом донором углерода, который входит в состав образовавшейся карбоксильной группы могут выступать различные соединения: фумарат, бикарбонат и др. Дальнейшее разложение алканов протекает также путем β-окисления.

К биодеградации циклоалканов способны бактерии родов Gordonia, Xanthobacter и др. Штаммы, деградирующие циклоалканы, имеют специфические ферментные системы, отличные от ферментных систем, использующихся микроорганизмами для окисления нециклических алканов [10].

Механизм расщепления ароматических структур

Стабильная резонансная структура ароматических углеводородов довольно устойчива к разрыву. Существуют две основные стратегии разрушения ароматической структуры, используемые микроорганизмами. Первая стратегия используется аэробными микроорганизмами, которые окисляют ароматическое кольцо до дигидроксиароматическх соединений (катехолов и гидрохинонов) с последующим окислительным раскрытием ароматического кольца. Вторая стратегия используется анаэробными микроорганизмами, способными восстанавливать ароматическое кольцо с дальнейшей дефрагментацией образовавшихся циклогексановых производных [10].

Незамещенные ароматические соединения, такие как бензол, нафталин, бифенил преобразуются аэробными микроорганизмами в соответствующие цис-1,2-дигидродиолы и далее в 1,2-дигидроксикатехолы. Этот процесс осуществляется семейством трехкомпонентных диоксигиназ, которые состоят из НАД-зависимой флавинредуктазы, электрон-транспортного белка на основе железосерных кластеров и диоксигеназной субъединицы. Окисление дигидродиола до дигидроксикатехола осуществляется НАД-зависимыми дегидрогиназами.

Диоксигеназные системы найдены в большинстве микроорганизмов, способных потреблять ароматические углеводороды: Pseudomonas, Rhodococcus, Acinetobacter, Alcaligenes, Bacterium spp. И др углеводородов и т. д.

Катехолы, обычно также являются продуктами ортогидроксилирования фенолов, осуществляемого ФАД-зависимыми монооксигеназами. Описаны два механизма дальнейшего расщепления ароматического кольца у образовавшихся катехолов: 1) интрадиоловый путь (орто-раскрытие), при этом происходит образование муконовой кислоты, и 2) экстрадиоловый путь (мета-раскрытие), с образованием альдегидной производной гидроксимуконовой кислоты. Эти процессы катализируются железосодержащими катехол-диоксигеназами.

При расщеплении катехолов по орто-пути, как это было изучено для штамма Pseudomonas putida, конечными продуктами являются янтарная и уксусная кислоты, которые далее вступают в цикл Кребса.

Расщепление катехолов по мета-пути, штаммом P. рutida, может идти двумя путями, приводящими к одним и тем же конечным продуктам. Согласно первому механизму, альдегид-2-гидроксимуконовой кислоты может окисляться под действием НАД-зависимой дегидрогеназы до 2-гидроксимуконовой кислоты, которая переходит под действием таутомеразы в таутомерную форму. Далее происходит декарбоксилирование. В соответствии со вторым механизмом, гидролитическое расщепление альдегида 2-гидроксимуконовой кислоты может осуществляться с образованием муравьиной и 2-гидроксипентадиеновой кислот. Под действием гидратазы 2-гидроксипентадионовая кислота далее переходит в 4-гидрокси-2-оксопентановую кислоту, которая под влиянием альдолазы расщепляется на ацетальдегид и пируват [10].

Ароматические соединения могут также расщепляться в анаэробных условиях. Центральной стадией расщепления ароматических углеводородов является стадия образования карбоксильного производного исходного субстрата. При этом донорами углерода, входящего в состав образовавшейся карбоксильной группы, могут выступать различные соединения: фумарат, бикарбонат и др. Далее происходит восстановление ароматического кольца с последующей дефрагментацией образовавшихся циклогексановых производных [10].

Механизм биодеградации полиароматических углеводородов

Полиароматические углеводороды (ПАУ) – очень опасные загрязнители, что обусловлено их токсичным, канцерогенным и мутагенным свойствами, а также медленным разложением в природных условиях. Бактерии и некоторые зеленые водоросли окисляют ПАУ, используя оба атома молекулярного кислорода (реакция катализируется диоксигеназой), при этом получается цисдигидродол, который затем подвергается дегидрогенизации, образуется катехол.

Самый простой ПАУ, с точки зрения химического строения – нафталин, состоящий из двух конденсированных бензольных колец. Бактерии, разрушающие нафталин, впервые выделены и описаны в 1927 г. Впервые метаболизм расщепления нафталина бактериями рода Pseudomonas описан еще в 1964 году.

Первым шагом при бактериальном разложении нафталина обычно является образование цис-1,2-дигидрокси-1,2-дигидронафталина, хотя в некоторых случаях могут образовываться цис-2,3-дигидрокси-2,3-дигидронафталин, под действием диоксигеназных систем. Кроме того, цис-дигидродиоловый метаболизм включает НАД-зависимую дегидрогенизацию, в результате чего получается 1,2-дигидроксинафталин. Следующий шаг – раскрытие ароматического кольца по мета-пути. Далее, под действием изомеразы, альдолазы и дегидрогеназы образуется салицилат. Для него описаны два метаболических пути разложения: через образование катехола и через образование гентизата. Для каждого из этих продуктов существует отдельный механизм биоразложения, осуществляемый различными ферментными системами: в случае катехола, конечными продуктами биоразложения являются ацетил - и сукценилкофермент А, а в случае гентизата – ацетоацетат и фумарат [10].

Использование углеводороокисляющих микроорганизмов в

биоремедиации

Под термином биоремедиация принято понимать применение технологий и устройств, предназначенных для биологической очистки почв и водоёмов от находящегося в них конкретного загрязнителя [26]. Существуют два принципиальных подхода к биодеградации нефтяных углеводородов в естественной среде: 1) стимуляция естественной нефтеокисляющей микрофлоры путем создания оптимальных условий для ее развития (внесение азотно-фосфорных удобрений, аэрация и пр.) и 2) введение в загрязненную экосистему активных углеводородокисляющих микроорганизмов наряду с добавками солей азота и фосфора.

Одним из перспективных биотехнологических методов ликвидации нефтезагрязнений водной поверхности, сточных вод, почв является использование микробных биопрепаратов, включающих в себя микроорганизмы-деструкторы нефтепродуктов, производимых в промышленных условиях. Внесение биопрепаратов в загрязненные водоёмы, почвы способствует утилизации нефтепродуктов, быстрому восстановлению природных экосистем, рекультивации почвы.

Современные нефтеокисляющие препараты представляют собой лиофильно высушенную биомассу активных штаммов, главным образом бактерий, в смеси с азотно-фосфорными соединениями; иногда в препарат включают нейтральный сорбент [12].

В настоящее время известен целый ряд биологических препаратов состоящих как из отдельных штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов, так и из микробных ассоциаций.