Выделение и изучение углеводородокисляющих бактерий (стр. 4 )

Занятие 2

Задание 1. Для постановки накопительной культуры внести в каждую из колб со средой стерильной пипеткой по 0,3 мл соответствующего нефтепродукта (нефть, гексадекан, дизельное топливо) и небольшое количество нефтезагрязненной почвы стерильным скальпелем. Колбы для инкубации поместить в термостат.

Задание 2. Приготовить 250 мл СПА в колбе; 10 пробирок с СПА; три пробирки с 5 мл воды; завернуть 12 чашек Петри, 3 шпателя.

Занятие 3

Задание 1. Расплавить СПА в колбе на водяной бане и разлить в 12 чашек Петри. Произвести рассев накопительной культуры в чашки Петри истощающим посевом. Чашки поместить в термостат.

Занятие 4

Задание 1. Просмотреть чашки с посевами. Описать преобладающие колонии. Изучить морфологические свойства бактерий из исследуемых колоний. Для этого приготовить фиксированные окрашенные препараты и просмотреть под микроскопом.

Задание 2. Отсеять чистые культуры на скошенный СПА в пробирках.

Занятие 5

Задание 1. Поверить выделенные культуры на чистоту:

1. путем микроскопирования; для этого приготовить и просмотреть под микроскопом фиксированный окрашенный препарат;

2. путем рассева изолятов на чашки Петри с СПА (использовать метод истощающего посева, приведенного выше).

Тема 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ АТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ ШТАММОВ

Занятия 6 – 10

Цель занятий 6–10: изучение углеводородокисляющей способности выделенных штаммов.

Оценка способности изолятов к росту на плотных средах

с нефтепродуктами

Готовят плотную среду № 1, стерилизуют и разливают в стерильные чашки Петри толстым слоем. После застывания среды, в центре агаровой пластинки стерильным пробочным сверлом диаметром 8–12 мм вырезают лунки. Культуры высевают радиальными штрихами от лунки к периферии чашки. Для посева используют густую суспензию клеток, полученную путем смыва односуточных культур 5 мл стерильной воды. В лунки стерильными пипетками вносят исследуемый углеводород (нефтепродукт). На чашке с одним источником углерода можно проверить рост нескольких культур. Посевы проводят в двух повторностях. Чашки помещают в термостат строго горизонтально, не переворачивая. Через 7–10 суток отмечают наличие или отсутствие роста по штриху в сравнении с контролем – ростом на среде без углеводорода (нефтепродукта).

Оценка способности изолятов к росту в жидкой среде

с нефтепродутами

Готовят жидкую синтетическую среду № 1, разливают по 30 мл в качалочные колбы, стерилизуют. После стерилизации в колбы добавляют в качестве источника углерода и энергии индивидуальные углеводороды, нефтепродукты в количестве 1 % (от общего объема). Колбы засевают 0,3 мл суспензии односуточной культуры и инкубируют в стационарных условиях при 30 °С.

Количество клеток исследуемой культуры определяют на 1-е, 3-е, 7-е сутки роста, используя метод серийных разведений с последующим высевом на чашки Петри с РПА [22]. Засеянные чашки инкубируют в термостате при температуре 30 °С в течение суток. Затем подсчитывают количество выросших колоний и определяют титр по следующей формуле:

, (1)

где Т – количество клеток в 1 мл среды, КОЕ/мл; К – количество выросших колоний; V – объем суспензии, мл; n – степень разведения.

По мере накопления биомассы судят о способности выделенных штаммов окислять углеводороды.

Оценка микробной деструкции нефтепродуктов весовым методом

Готовят жидкую питательную среду (№ 2) следующего состава(г/л): NH4Cl – 2,5; CaCl2 · 6H2O – 0,01; MgCl2 · 4H2O – 0,02; Na2HPO4 – 10,0; KH2PO4 – 1,0; MgSO4 · 7H2O – 0,2; FeSO4 · 7H2O – 0,01; NaCl – 5,0. В качестве источника углерода в среду вносят 2,5 % исследуемого нефтепродукта [5].

Культивирование проводят в колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл жидкой питательной среды указанного состава, на круговой качалке (180 об/мин) при 24 °С в течение 10–14 дней. Инокулирование колб с нефтепродуктами производят суспензией микроорганизмов (5 мл на 100 мл среды) с определенной величиной оптической плотности.

После окончания роста содержимое колб подвергают экстракции хлороформом. Пробы культуральной жидкости и контроля (среда с нефтепродуктом без внесения микроорганизмов) объемом по 100 мл экстрагируют встряхиванием с 50 мл хлороформа в течение 30 мин. Хлороформный экстракт отделяют центрифугированием при 4000 об/мин и высушивают в стакане над 3 г безводного сульфита натрия. Аликвоты (5 мл) хлороформного экстракта переносят в предварительно взвешенные с точностью до 0,0001 г градуированные пробирки объемом 10 мл. Для удаления хлороформа пробирки в положении под углом 45 ° помещают в вентилируемый термостат при 70–75 °С на 3,5–4 часа, выдерживают в течение ночи и взвешивают (Pi). Оценка нефтеразлагающей активности (А, %) весовым способом осуществляется с учетом данных, полученных для контроля:

(2)

Оценка пригодности нефтезагрязненной почвы, очищенной с помощью биодеструктора, для выращивания растений

Для исследований берут контейнеры с почвой. В опытные варианты контейнеров (В-1, В-2) вносят нефть до 2 %. Затем в почву варианта В-1 добавляют суспензию нефтеутилизирующего штамма до концентрации 1·105 кл/см3. Третий контрольный вариант (К) содержит почву без нефти и биодеструктора. Все варианты опыта и контроля выдерживают в течение 25 дней при комнатной температуре и влажности грунта 50–60 %, после чего в них вносят семена огурца и гороха. Наблюдения за проростками в опытах проводят в течение двух месяцев. Определяют всхожесть семян в процентах по отношению к контролю [3].

Оценка углеводородокисляющей способности микроорганизмов

при помощи метода «нитроцеллюлозных фильтров»

Принцип метода заключается в том, что нефть или нефтепродукты наносятся на поверхность носителя в виде раствора в инертном растворителе. При этом углеводороды равномерно распределяются на поверхности агара в чашках Петри, чего сложно добиться в обычных условиях из-за гидрофобности указанных субстратов [20].

Для проведения исследований готовят среду следующего состава (г/л): NH4Cl – 2,5; CaCl2 · 6H2O – 0,01; MnCl2 · 4H2O – 0,02; MgSO4 · 7H2O – 0,2; FeSO4 · 6H2O – 0,01; NaCl – 5,0; Na2HPO4 – 10,0; KH2PO4 – 1,0; агар – 20. Концентрация нефти (нефтепродукта) в среде – 2 %. После стерилизации среду разливают в чашки Петри.

В стеклянной емкости готовят раствор нефти или нефтепродукта в хлороформе в соотношении хлороформ-нефть 40:1. В случае использования мазута или тяжелых фракций нефти соотношение растворитель-углеводород увеличивают до 60:1. В приготовленный раствор погружают нитроцеллюлозные фильтры «Сынпор» (Чехия) № 2 или № 3 до полной пропитки их раствором нефтепродуктов (на несколько секунд). Пропитанные таким образом фильтры сушат в течение 30 минут на листах фильтровальной бумаги под кварцевой лампой.

На поверхность среды делают высев из почвенной болтушки, накрывают сверху подготовленным по вышеуказанному методу фильтром, прижимают его шпателем и разглаживают. Засеянные чашки инкубируют в термостате в течение 6–7 суток, помещая крышкой вверх во избежание отставания фильтра от агаризованной поверхности. Нефтедеструктивную активность исследуемых культур микроорганизмов оценивают по интенсивности зон просветления, которые образуются при потреблении нефти в зоне микробных колоний. Формирование подобных зон связано с тем, что в местах роста микроорганизмов содержание нефти снижается за счет ее утилизации, что способствует снижению оптической плотности фильтра в этих зонах, и в проходящем свете зоны кажутся более светлыми. По скорости появления зон просветления и их размеру можно отобрать наиболее активные клоны.

Занятие 6

Задание 1. Приготовить 250 мл плотной среды № 1 в колбе; пробирки с 5 мл воды; разлить нефтепродукты во флаконы; завернуть 8 чашек Петри, сверло и отдать на стерилизацию.

Задание 2. Приготовить 4 колбы с 30 мл жидкой синтетической среды № 1; завернуть 5 пипеток на 1 мл и отдать на стерилизацию.

Задание 3. Приготовить 4 колбы с 100 мл жидкой питательной среды № 2.

Задание 4. Посеять в пробирки со скошенным СПА исследуемые штаммы нефтеокисляющих бактерий.

Занятие 7

Задание 1. Расплавить СПА в колбе и разлить в 10 чашек Петри толстым слоем (~ 4 мм). После застывания среды стерильным сверлом вырезать лунки. Сделать смыв исследуемых культуры 5 мл воды. Использовать полученные суспензии для посева. Провести посев петлей по радиусу чашки от лунки к периферии. В лунки стерильной пипеткой внести исследуемый нефтепродукт (нефть, гексадекан, дизельное топливо, мазут). Две чашки оставить для контроля, не добавляя нефтепродукты. Поместить чашки в термостат строго горизонтально, не переворачивая.

Задание 2. В колбы с 30 мл жидкой синтетической среды № 1 добавить по 0,3 мл соответствующего нефтепродукта (нефть, гексадекан, дизельное топливо, мазут) и внести по 0,3 мл суспензии исследуемой культуры. Поместить в термостат с температурой 30 °С.

Задание 3. В колбы с 100 мл жидкой питательной среды № 2 внести 2,5 мл соответствующего нефтепродукта (нефть, гексадекан, дизельное топливо, мазут) и 5 мл суспензии исследуемой культуры. Поместить колбы на круговую качалку (180 об/мин) и культивировать при температуре 24 °С в течение 14 суток.

Задание 4. Приготовить 200 мл СПА в колбе; 5 пробирок с 9 мл физиологического раствора (0,85 % NaCl); завернуть 6 пипеток на 1 мл; 2 микропипетки; 6 чашек Петри, один шпатель и отдать на стерилизацию.

Задание 5. Приготовить три контейнера с 300 г почвы (В-1, В-2 и К). В контейнер В-1 внести 2 % нефти и суспензию исследуемого штамма до концентрации 1·105 кл/см3. В контейнер В-2 добавить 2 % нефти, в контейнер К (контрольный вариант) – не вносить нефть и бактериальную суспензию. Все контейнеры оставить при комнатной температуре на 25 суток.

Занятие 8

Задание 1. Просмотреть чашки Петри с лунками, отметить наличие или отсутствие роста по штриху в сравнении с контролем – ростом на среде без нефтепродуктов. Степень роста оценить визуально, пользуясь условными обозначениями: «+++» – обильный рост; «++» – умеренный рост; «+» – слабый рост; «+ -» – скудный рост; «-» – отсутствие роста.