Выделение и изучение углеводородокисляющих бактерий (стр. 6 )

Способность бактерий к восстановлению нитратов можно определить при культивировании в МПБ с добавлением 0,2 % КNO3. Среду разливают в пробирки по 5 мл, опускают поплавки и стерилизуют при 1 атм. Проводят посев и культивируют в термостате при 30 °С в течение 7 суток. Отмечают накопление в поплавке газа (N2) и определяют наличие в среде нитритов при помощи реактива Грисса.

Реакция основана на образовании в кислой среде в присутствии нитритов и ароматических аминов (сульфаниловой кислоты и α-нафтиламина) азосоединения, окрашенного в красно-розовый цвет. Для выполнения реакции к капле реактива Грисса добавляют каплю культуральной жидкости. Появление красного окрашивания свидетельствует о присутствии нитритов.

Оксидазная активность. Используют «Окситест» – индивидуальный тест для обнаружения цитохромоксидазы. При помощи петли биомассу суточных культур втирают в зону индикации в течение одной минуты. Результат учитывают по появлению синей окраски в течение 0,5–1 минуты.

Каталазная активность свойственна большинству аэробных микроорганизмов. Каталаза разлагает перекись водорода с образованием воды и молекулярного кислорода. Каталазную активность выявляют следующим образом. Выращивают односуточную культуру на РПА в чашке Петри или пробирке. На поверхность колонии (или штриха) наносят каплю свежеприготовленного 10%-ного раствора перекиси водорода или суспендируют клетки исследуемого микроорганизма в небольшом объеме этого раствора. Выделение кислорода, хорошо заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствует о положительной реакции. Можно выращивать бактерии в жидкой среде. В этом случае к 1 мл культуральной жидкости добавляют 1 мл раствора перекиси водорода. Значение Рн должно быть около 7.

Твин-эстеразная активность. Твины – эфиры жирных кислот и сорбита. Готовят фон среды следующего состава (%): пептон – 1; NaCl – 0,5; CaCl2 – 0,01. Стерилизуют при 1 атм. Водный раствор твина стерилизуют отдельно при 0,5 атм., затем добавляют в среду, такое количество, чтобы его конечная концентрация в среде составляла 1 %. Приготовленную среду разливают в чашки Петри. Посев проводят штрихом по радиусу чашки и культивируют в течение 7 суток в термостате при температуре 30 °С. Положительную реакцию учитывают по наличию непрозрачных зон кальциевых солей жирных кислот вокруг штриха.

Протеолитическая активность. Способность продуцировать коллагеназу определяют на мясо-пептонной желатине (МПЖ). Для этого к МПБ добавляют 15 % желатины, оставляют на 20–30 мин. для ее набухания, затем смесь нагревают на водяной бане до полного растворения желатины и разливают в пробирки по 5 мл. Автоклавируют при 0,5 атм. 30 мин. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования – 7–10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально. При положительной реакции указывают интенсивность и форму разжижения.

Для определения способности использовать казеин молока, проводят посев культуры в пробирки со стерильным обезжиренным молоком. Результаты регистрируют после 7-ми суточной инкубации. При высокой активности казеинолитических ферментов отмечается «просветление» молока, называемое пептонизацией.

Также протеолитическую активность определяют при росте культуры на молочном агаре. В стерильный 2,5%-ный водный агар добавляют обезжиренное молоко в количестве 1/3 от общего объема среды, тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри. Посев проводят уколом. При использовании казеина вокруг укола образуется светлый ореол.

Амилолитическую активность исследуют на среде следующего состава (%): пептон – 1; КН2РО4 – 0,5; растворимый крахмал – 0,5; агар – 2. Проводят посев культуры штрихом по диаметру чашки, культивируют в течение 7 суток, после чего агаровую пластинку заливают раствором Люголя. Так как йод индикатор на крахмал, то вся среда окрашивается в синий цвет, за исключением зоны гидролиза крахмала, которая остается бесцветной или может приобрести красно-бурую окраску, если крахмал гидролизуется до декстрина.

Лецитиназная активность. При изучении штаммов, выделенных из природных источников, определяют способность продуцировать лецитиназу. Этот фермент рассматривается как один из факторов патогенности, он повреждает фосфолипидный бислой в мембране клеток. В связи с тем, что субстратом при этом часто служит фосфолипид лецитин (фосфатидилхолин), фермент называют лецитиназой или фосфолипазой. Под действием лецитиназы лецитины расщепляются на фосфохолины и нерастворимые в воде диглицериды. Наличие фосфолипазы свидетельствует о патогенном потенциале микроорганизма. Для определения лецитиназной активности используют следующие среды.

Желточно-солевая среда. К 100 мл стерильного физиологического раствора (0,85%-ный раствор NaCl) добавляют один яичный желток. Перед извлечением желтка вымытое в мыльном растворе куриное яйцо выдерживают в течение 20 минут в 96%-ном спирте. Полученную среду разливают в стерильные пробирки по 5 мл, проводят посев культуры петлей. Засеянные пробирки инкубируют при 30 °С, результат учитывают на 3-е сутки. При наличии лецитиназы наблюдается образование на поверхности среды плотного сгустка из нерастворимых жирных кислот, который всплывает наверх, а под ним остается почти прозрачная жидкость.

Яично-желточный агар. Готовят 100 мл голодного агара (2%-ный водный агар), стерилизуют при 1 атм., охлаждают до 40–45 °С, добавляют яичный желток, растворенный в 20 мл физиологического раствора. Приготовленную среду разливают в чашки Петри, проводят посев уколом, инкубируют сутки в термостате при 30 °С. При положительной реакции вокруг роста по уколу появляется опалесцирующая зона.

Уреазная активность. Для определения уреазной активности используют методику Загса. Готовят концентрированный самостерилизующийся раствор мочевины (1 часть мочевины, 1 часть 96%-ного этилового спирта, 2 части дистиллированной воды). Раствор хранят при температуре + 4…+ 10 °С. Перед употреблением 1 часть раствора мочевины разводят в 19 частях солевого раствора, содержащего 0,1 г KH2PO4, 0,1 г K2HPO4, 0,5 г NaCl, 1 мл 0,2%-ного раствора фенолового красного, растворенных в 100 мл воды. Смесь разливают по 0,1 мл в пробирки, засевают в нее густую суспензию односуточной культуры и инкубируют в термостате 30 мин. При выделении уреазы смесь окрашивается в розовый цвет.

Продуцирование аммиака и сероводорода определяют при росте в МПБ с лакмусовой (для определения образования аммиака) и свинцовой (для выявления способности образовывать сероводород) бумагой. Реакцию выявляют по изменению цвета бумаги.

Рост на синтетической среде. Используют среду следующего состава (г/л): глюкоза – 20; NH4NO3 - 0,3; KH2PO4 - 0,1; K2HPO4 - 0,1; MgSO4 - 0,05; NaCl – 0,05; CaCО3 – 0,5; FeSО4 – следы; агар – 20. Среду разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 0,5 атм. Посев проводят штрихом на скошенную среду, инкубируют 7 суток при температуре 30 °С, визуально отмечают рост или его отсутствие. На синтетической среде растут микроорганизмы, которые в качестве источника азота используют азот минеральных солей и не требуют внесения в среду готовых витаминов или других факторов роста.

Рост на безазотистой среде Эшби. Используют среду следующего состава (г/л): манит – 20; K2HPO4 - 0,2; MgSO4 - 0,2; NaCl – 0,2; К2SО4 – 0,1; CaCО3 – 5,0; агар – 15. Среду разливают в пробирки, стерилизуют при 0,5 атм., посев проводят штрихом, культивируют 7 суток. На среде Эшби могут расти азотфиксирующие бактерии и олигонитрофилы (микроорганизмы, способные усваивать ничтожные количества связанного азота, содержащегося в реактивах, воде и воздухе). Обильный рост на среде Эшби может свидетельствовать о принадлежности бактерий к азотфиксаторам.

Для выявления способности бактерий рода Pseudomonas к пигментобразованию штаммы высевают на среду, оптимальную для флуоресценции, Кинг В (г/л): пептон – 2; глицерин – 1; K2HPO4 – 0,15; MgSO4 – 0,15, агар – 1,6; дистиллированная вода. Способность бактерий к синтезу иных пигментов исследуют на агаризованной среде Кинг А (%): пептон–2, K2SО4 –2; глицерин – 2; MgCl2 – 0,7; агар – 1,6.

Определение температурных параметров роста. Для этого проводят культивирование штаммов на скошенном РПА при температуре от 5 до 40 °С.

Определение солевых параметров роста. Изучают путем посева культур в жидкие среды (МПБ, синтетические среды с нефтепродуктами) с различным содержанием NaCl (0; 0,5; 2,5; 6,5; 10; 12; 15 %).

Определение ростовых значений рН среды. Изучают влияние рН среды на рост микроорганизмов в диапазоне от 4,0 до 10,0.

Занятие 16

Задание 1. Приготовить питательные среды для изучения морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств штаммов углеводородокисляющих бактерий.

Занятие 17

Задание 1. Посеять исследуемые культуры в питательные среды.

Занятие 18

Задание 1. Исследовать морфолого-культуральные свойства штаммов.

Задание 2. Учесть результаты опытов по изучению физиолого-биохимических признаков культур.

Задание 3. Провести идентификацию исследуемых штаммов бактерий по определителю Берджи [18].

Вопросы к разделу II

1.  Какие субстраты может использовать исследователь для выделения углеводородокисляющих бактерий, находясь в городской среде?

2.  Как получить накопительную и чистую культуру УОБ?

3.  Какие методы применяют для определения углеводородокисляющей активности изолятов? Какой метод является наиболее экспрессным при первичном скрининге УОБ?

4.  С какой целью изучают эмульгирующую активность УОБ и их гидрофильно-гидрофобные свойста?

5.  Какой комплекс признаков используют для идентификации УОБ?

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.  Барышникова нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде / , , и др. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2001. – Т. 37, № 5. – С. 542-548.

2.  Никовская -гидрофильные свойства микроорганизмов при различных условиях культивирования / , , // Микробиология. – 1989. – Т. 58, Вып. 3. – С. 448-451.