Выделение и изучение углеводородокисляющих бактерий (стр. 1 )

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Иркутский государственный университет»

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Методические указания для практических занятий по Большому практикуму

Иркутск 2010

УДК 579(076.5)

ББК 28.4я73

В-99

Печатается по решению учебно-методической комиссии биолого-почвенного факультета Иркутского государственного университета

Научный редактор д-р биол. наук, проф.

Рецензенты: д-р. биол. наук, проф.

(Лимнологический институт СО РАН),

канд. биол. наук, доц.

(ГОУ ВПО Иркутский государственный университет)

Вятчина , идентификация и изучение некоторых свойств углеводородокисляющих бактерий: Метод. указания / . – Иркутск: Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. – 41 с.

В методических указаниях изложены методики, позволяющие получать культуры углеводородокисляющих бактерий, осуществлять первичный скрининг наиболее активных штаммов. Также приведены методы по оценке эмульгирующей активности и изучению гидрофильно-гидрофобных свойств бактерий-нефтедеструкторов. Рассмотрен ряд тестов и питательных сред, используемых при идентификации нефтеокисляющих бактерий.

Методические указания предназначены для проведения практических занятий по Большому практикуму со студентами специальностей «Биология» (специализация «Экологическая микробиология») и «Экология» (специализация «Экологическая экспертиза»), а также для студентов, выполняющих курсовые и дипломные работы по тематикам, связанным с изучением углеводородокисляющих бактерий.

СОДЕРЖАНИЕ

Предисловие ………………………………………………………………….4

Раздел I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ…………………….5

Раздел II. ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ…………………………………...16

Тема 1. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ…………………………………16

Тема 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ ШТАММОВ………………………………….20

Тема 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭМУЛЬГИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ ШТАММОВ………………………………..26

Тема 4. ИЗУЧЕНИЕ ГИДРОФИЛЬНО-ГИДРОФОБНЫХ СВОЙСТВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ…………………………………28

Тема 5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ШТАММОВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ…………………………………30

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА……………………………………....38

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА……………………………………..38

ПРИЛОЖЕНИЕ……………………………………………………………...42

ПРЕДИСЛОВИЕ

Методические указания предназначены для проведения практических занятий по Большому практикуму со студентами IV курса специальностей «Биология» (специализация «Экологическая микробиология») и «Экология» (специализация «Экологическая экспертиза»). Учебно-методическое издание окажется полезным для студентов, которые занимаются научно-исследовательской работой, связанной с изучением углеводородокисляющих микроорганизмов.

В первом разделе представлены сведения по систематическому разнообразию углеводородокисляющих микроорганизмов, их использованию для ликвидации нефтезагрязнений, механизмы биодеградации углеводородов нефти. Приведенные материалы позволят студентам получить определенный объем знаний по изучаемой группе микрооорганизмов, что необходимо для успешного проведения практических работ. Во втором разделе даются методы получения накопительной и чистой культур нефтеокисляющих бактерий. Рассмотрен ряд методик по оценке углеводородокисляющей активности изолятов, эмульгирующих и нефтеотмывающих свойств культуральной жидкости, определению показателя гидрофобности микробных клеток, что позволяет осуществить первичный скрининг наиболее перспективных штаммов. Также приводится набор тестов и питательных сред, необходимых для определения родовой принадлежности выделенных культур.

Раздел I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Cистематическое разнообразие углеводородокисляющих

микроорганизмов, их распространение в природе

Углеводородокисляющие микроорганизмы широко распространены в природе. Они выделяются из разнообразных водных и почвенных экосистем [3], особенно загрязнённых углеводородами или нефтью [6, 23], а также из микрофлоры нефти и пластовых вод нефтяных месторождений [14, 15, 16].

Наиболее распространенными в загрязненных нефтью местообитаниях являются бактерии, а именно представители родов Rhodococcus, Pseudomonas, Arthrobacter и Acinetobacter. В хронически загрязненных экосистемах безусловным доминантом являются родококки, что связано с их метаболическими особенностями и устойчивостью к неблагоприятным воздействиям [12].

Численность бактерий-нефтедеструкторов в естественных биоценозах составляет порядок 0,1 % от общей численности микрофлоры. Как правило, она резко возрастает при попадании нефти и нефтепродуктов на поверхность на поверхность почвы или воды, а также в грунтовые воды [23].

В последние десятилетия наблюдается большой интерес исследователей к изучению подземных экосистем. Нефтяные пласты, как правило, не содержат растворенного кислорода, в связи с этим основное внимание исследователей привлекали анаэробные микроорганизмы. Тем не менее, аэробные микроорганизмы также обитают в нефтяных пластах, куда они проникают с нагнетаемой водой и буровым раствором. Нагнетаемые воды часто содержат растворенный кислород, и в призабойной зоне нагнетательных скважин создается аэробная зона, способствующая росту аэробных бактерий.

Аэробная микрофлора включает организмы, специализированные на окислении метана (метанокисляющие), а также неспецифические органотрофы, включающие в свою очередь углеводород - или нефтеокисляющие бактерии [15].

Традиционными микробиологическими методами в нефтяных пластах, имеющих температуру от 20 до 40 ºС, были обнаружены мезофильные представители родов Pseudomonas, Rhodococcus, Brevibacterium, Micrococcus, Arthrobacter, Methylobacter, Methylocjccus, Methylocystis. Разнообразная и активная мезофильная микрофлора обнаружена в нефтяном месторождении Дацин (КНР). Молекулярно-биологическим методом была установлена таксономическая принадлежность бактерий к родам Bacillus, Brevibacillus, Rhodococcus, Dietzia, Kocuria, Gordonia, Cellulomonas, Clavibacter, Pseudomonas, Acinetobacter [16, 25].

Из пластовой воды высокотемпературного нефтяного месторождения Даган (КНР) выделены термофильные бактерии рода Geobacllus и актинобактерии рода Thermoactinomyces. Мезофильные бактерии относились к родам Micrococcus, Mycobacterium, Cellulomonas, Pseudomonas, Acinetobacter, а также к β–подклассу Proteobacterium. По всей вероятности, мезофильная микрофлора была внесена в нефтяной пласт с поверхности, тогда как для термофильной микрофлоры не исключается аборигенный характер [16].

Из нефти и пластовых вод месторождений Татарстана, Западной Сибири, Вьетнама выделены мезофильные нефтеокисляющие бактерии, которые были отнесены к родам Rhodococcus, Gordonia, Dietzia, Pseudomonas Исследованные микроорганизмы росли за счет окисления ацетата, пропионата, бутирата, этанола и сахарозы. А также окисляли н-алканы сырой нефти с длиной углеродной цепи от С12 до С28-С30. При определенных температурах высокомолекулярные парафины синтезировались клетками псевдомонад при их росте на нефти в присутствии солей жирных кислот. Приведенные наблюдения позволяют считать жизнедеятельность углеводородокисляющих бактерий одним из факторов, вызывающих утяжеление и увеличение вязкости остаточной нефти в призабойных зонах нагнетательных скважин заводняемых нефтяных месторождений [8].

В нефтяных пластах распространены сульфатредуцирующие бактерии, способные осуществлять анаэробную биодеградацию нефти в пределах температур от 18 до 80 °С. Обычными обитателями нефтяных пластов, имеющих температуру от 20 до 80 °С, и низкоминерализованных пластовых вод являются метаногены (Metanobacterium, Metanothermobacter), окисляющие водород с одновременным восстановлением углекислоты в метан. Бродильные бактерии обычно выделяли из нефтяных пластов на сложных белковых или углеводных субстратах, не свойственных этой экосистеме. Уникальны исследования Штеттера и соавторов, выделивших из нефтяных пластов Аляски и Северного моря гипертермофильных архей рода Pyrococcus, растущих на сырой нефти. Штеттер и соавт. Полагают, что эти организмы являются обитателями морских гидротерм и в нефтяной пласт проникли с нагнетаемой морской водой [15].

В настоящее время идет активный поиск психрофильных углеводородокисяющих микроорганизмов, способных использовать углеводороды нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах.

Углеводородокисляющей активностью обладают также представители актиномицетов, микромицетов и дрожжей. Среди актиномицетов внимание привлекает многочисленный род Streptomyces. Так, например, из 56 штаммов рода Streptomyces, выделенных из почв Алтая и Томской области, способность к усвоению углеводородов и накоплению биомассы выявлена у 48 штаммов, относящимся к сериям Cinereus и Albus, а также Roseus и Helvolo-flavus [1].

Сообщений об утилизации углеводородных субстратов мицелиальными грибами немного, тем не менее, из морских экониш выделены грибы-деструкторы углеводородов, принадлежащие к 27 родам (роды Trichoderma, Mortierella, Aspergillus, Penicillium и др.), среди изолятов – деструкторов почвенного происхождения упоминаются грибы, принадлежащие к 31 роду [7]. Показана способность к деструкции сырой нефти и отдельных ее фракций культур зигомицетов Cunninghamella japonica и Motierella alpina [19].

Механизмы деградации углеводородов микроорганизмами

Углеводороды практически нерастворимы в воде, что затрудняет их поглощение микробными клетками и ферментативное разложение. Условием эффективного разложения углеводородов является обширная поверхность раздела фаз углеводород–вода. Поэтому большинство микроорганизмов, способных использовать алканы, выделяют для диспергирования подобных субстратов ПАВы (поверхностно-активные вещества) – низкомолекулярные, внеклеточные и связанные с клеткой вещества. В настоящее время известно пять групп биологических ПАВ (биоПАВ): гликолипиды, липополисахариды и полисахаридные комплексы, липопептиды, жирные кислоты и нейтральные липиды.