Выделение и изучение углеводородокисляющих бактерий (стр. 3 )

Микробиологический препарат «Деворойл»

Биопрепарат «Деворойл» является совместной разработкой института Микробиологии АН России и Научно-производственного предприятия «Биотехинвест».

Препарат предназначен для биодеградации нефти и нефтепродуктов при загрязнении почв, водоемов, поверхностей акваторий, а также внутренних поверхностей танков нефтеналивных судов и прочих резервуаров.

Микробиологический препарат «Деворойл» состоит из тщательно подобранного сообщества углеводородоокисляющих бактерий и дрожжей. В состав ассоциации входят вегетативные клетки непатогенных штаммов культур родов Rhodococcus, Pseudomonas и Yarrowia. Бактерии способны окислять нефтяные n – алканы длиной цепи С9 – С30 и ароматические углеводороды, в частности, фенол, крезол и пирокатехин. Норма внесения препарата составляет 1кг/га при уровне загрязнения до 5 %. При большем уровне загрязнения (10 – 15 %) количество вносимого препарата следует увеличить до 2 – 3 кг [13].

Микробиологический препарат «Дестройл»

«Дестройл» – препарат для ликвидации нефтяных загрязнений воды и почвы, получен на основе выделенной из природы микробной культуры Acinetobacter sp. Представляет собой порошок с числом жизнеспособных клеток в 1 грамме не менее 100 млн. и степенью биохимического окисления нефтепродуктов (СБОН) не менее 75 %, или пасту с числом жизнеспособных клеток в 1 грамме не менее 1 млрд. и СБОН не менее 85 %. Оптимальные условия нефтеокисляющего действия: температура – (24±5) °С, pH среды – 6,0-8,0.

Препарат обладает высоко выраженной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов, вызывая в них глубокие необратимые процессы деградации до остаточных продуктов, относящихся к экологически нейтральным соединениям.

Основной способ применения – нанесение суспензий препарата концентрацией от 0,3 до 0,5 % на загрязненные поверхности. «Дестройл» в виде порошка перед применением подвергается активации – выдержке при температуре 23-32 °С в течение 4-6 часов в присутствии азотно-фосфорных удобрений (аммофос, диаммофос, нитроаммофос).

Микробиологический препарат «Путидойл»

Микробиологический препарат «Путидойл» производится на основе монокультуры Pseudomonas putida. Окислительная способность микробиологического препарата «Путидойл» составляет 240,5-264,0 мг CO2 за 30 суток.

«Путидойл» в сочетании с набором минеральных солей наносят на загрязненную поверхность воды и почвы в дозе 0,4-4 г на 1 кг нефтепродукта. Обработка загрязненных нефтью и нефтепродуктами водных и почвенных поверхностей с использованием бактериального препарата осуществляется с помощью самоходных транспортных средств, оборудованных нагнетательными насосами и распылительными устройствами. Бактериальный препарат «Путидойл» обладает высоко выраженной окислительной активностью в отношении углеводородов прямой, разветвленной и циклической структур.

Вопросы к разделу I

1.  Насколько широко распространены углеводородокисляющие микроорганизмы в природе?

2.  Какие углеводородокисляющие бактерии доминируют в хронически загрязненных нефтепродуктами экосистемах?

3.  Какие группы бактерий включает аэробная микрофлора нефтяных пластов? Какие анаэробные прокариоты встречаются в нефтяных пластах? Что является субстратом для их развития?

4.  Назовите представителей актиномицетов, микромицетов и дрожжей, обладающих углеводородокисляющей способностью?

5.  Какие этапы включает процесс нефтедеструкции? Какова роль биосурфактантов?

6.  Каковы механизмы биодеградации алифатических, ароматических и полиароматических углеводородов? Какие углеводороды труднее поддаются микробному разложению?

7.  Что Вы понимаете под термином «биоремедиация»? Какие микробиологические нефтеокисляющие препараты знаете?

Раздел II

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Тема 1. ПОЛУЧЕНИЕ НАКОПИТЕЛЬНЫХ И ЧИСТЫХ КУЛЬТУР УЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Занятия 1 – 5

Цель занятий 1–5: постановка накопительной культуры углеводородокисляющих бактерий и выделение чистых культур.

Для получения культур углеводородокисляющих бактерий (УОБ) используют образцы загрязненных нефтепродуктами почв и вод, образцы пластовых вод из добывающих скважин, нефть [8, 12, 16]. Источником выделения УОБ могут быть длительно хранившиеся нефтепродукты, например, гексадекан [9]. Изоляты УОБ выделяли из грунтов зоны вечной мерзлоты Якутии, илов и торфов, донных осадков и воды озера Байкал [3].

Метод накопительных культур

Для выделения УОБ из различных субстратов используют метод накопительных культур. Для этой цели в качалочных колбах готовят по 30 мл среды (№ 1) следующего состава (%): КNO3 – 0,40; MgSO4 · 7H2O – 0,08; KН2PO4 – 0,06; Na2HPO4 – 0,14; pH 7,2 – 7,3. Колбы с приготовленной средой стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 30 мин. После стерилизации в колбы добавляют в качестве источника углерода и энергии стерильный нефтепродукт (нефть, гексадекан, дизельное топливо, мазут) в количестве 1 % (от общего объема). Нефтепродукты стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 30 мин.

Для получения накопительной культуры в колбы с приготовленной средой вносят образец нефтезагрязненной почвы при помощи стерильного скальпеля. Колбы инкубируют на качалке при 190–220 об/мин или в стационарных условиях в термостате при температуре 30 °С в течение 7–10 суток. Затем визуально оценивают рост в колбах с накопительной культурой. Учитывают помутнение среды, что свидетельствует о приросте биомассы, и степень изменения эмульсии по сравнению с контролем (среды с нефтепродуктами без внесения микроорганизмов). Факт диспергирования нефтепродукта говорит о том, что данный штамм в определенных условиях культивирования способен синтезировать и секретировать ПАВ, эмульгирующее нефтепродукт [2]. Для дальнейших исследований используют колбы с наибольшим помутнением среды.

Выделение чистых культур углеводородокисляющих бактерий

Бактерии, окисляющие углеводороды, являясь полифагами, обычно растут и на белковых средах, поэтому для выделения чистых культур УОБ можно использовать сухой питательный агар (СПА). СПА готовят в колбах, стерилизуют при 1 атм. в течение 30 мин. Перед посевом приготовленную среду разливают в стерильные чашки Петри. Затем прокаленной в пламени спиртовки петлей берут эмульсию с поверхности среды в колбе с накопительной культурой, вносят в пробирку с 5 мл стерильной воды, и суспензируют. После этого вновь прожигают петлю, берут каплю полученной суспензии («зеркальце»), наносят на поверхность среды в первой чашке Петри. Стерильным шпателем Дригальского равномерно распределяют посевной материал по поверхности агаровой пластинки. Затем этим шпателем последовательно проводят посев в трех следующих чашках.

Такой способ истощающего посева позволяет получить изолированные колонии. Посевы инкубируют в термостате при 30 °С в течение 7 суток. После чего просматривают чашки Петри, оценивают разнообразие выросших колоний и описывают их по следующей схеме:

форма колонии – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т. д.;

размер (диаметр) колонии измеряют в мм; если размеры колоний не превышают 1 мм, то их называют точечными;

поверхность колонии – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

профиль колонии – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т. д.;

блеск и прозрачность – колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;

цвет колонии – бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная – белая, желтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная и т. д., отмечают выделение пигмента в субстрат;

край колонии – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.;

структура колонии – однородная, мелко - или крупнозернистая, струйчатая и т. д.;

консистенция колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой, пленчатой, хрупкой.

Исследуют морфологические признаки клеток бактерий из колоний. Для этого готовят фиксированный окрашенный препарат. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю стерильной воды, в которую вносят небольшое количество бактериальной массы стерильной петлей, тщательно перемешивают. Полученную суспензию распределяют тонким слоем по стеклу на площади 1–2 см2. Приготовленный мазок высушивают в струе теплого воздуха высоко над пламенем спиртовки, держа стекло мазком вверх. При этом недопустимо перегревание препарата, иначе клетки микроорганизмов деформируются. Затем препарат фиксируют, трижды пронося через наиболее горячую часть пламени спиртовки, держа предметное стекло мазком вверх. Окрашивают препарат, используя модифицированный метод Синева, т. е. на мазок помещают фильтровальную бумагу, пропитанную генциан фиолетовым или фуксином, увлажняют ее водой (бумага должна плотно прилегать к стеклу) и окрашивают в течение 3–5 мин. После окраски препарат тщательно промывают водой, высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой. Затем на сухой препарат помещают каплю иммерсионного масла и просматривают под микроскопом с увеличением объектива 90×. Определяют форму клеток, чистоту культуры. Зарисовывают микроскопическую картину.

Проводят отсев выделенных культур в пробирки со скошенным СПА, которые инкубируют в термостате при 30 °С в течение 7 суток. Чистоту изолятов подтверждают путем рассева культуры из пробирок в чашки Петри с СПА, используя истощающий посев.

Занятие 1

Задание 1. Приготовить жидкую среду № 1 в трех качалочных колбах по 30 мл; разлить нефтепродукты (нефть, гексадекан, дизельное топливо) во флаконы; завернуть 3 пипетки на 1 мл, скальпель и отдать на стерилизацию. Нефтепродукты стерилизовать во флаконах, закрытых резиновыми пробками с тефлоновым покрытием, закрепленными металлическими колпачками.

Задание 2. К следующему занятию принести пробы почвы, загрязненной нефтепродуктами. Отбор проб можно производить у бензоколонки, гаража и т. д.