Выделение и изучение углеводородокисляющих бактерий (стр. 5 )

Задание 2. Определить количество клеток исследуемого штамма нефтеразрушающей бактерии в жидкой синтетической среде № 1. Для этого приготовить ряд разведений: 10-1, 10-2, 10-3; 10-4; 10-5. Из двух последних разведений произвести посев: на поверхность среды в чашках Петри с СПА нанести по 0,02 мл культуральной жидкости и равномерно распределить ее по агаровой пластинке. Из каждого разведения сделать три параллельных посева. Поместить чашки в термостат с температурой 30 °С.

Занятие 9

Задание 1. Подсчитать количество выросших колоний в чашках Петри с СПА и определить титр по формуле (1).

Задание 2. Оценить микробную деструкцию нефтепродуктов весовым методом (см. выше).

Занятие 10

Задание 1. Оценить пригодность нефтезагрязненной почвы, очищенной с помощью биодеструктора, для выращивания растений. Для этого определить всхожесть семян в процентах по отношению к контролю.

Тема 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭМУЛЬГИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Занятия 11 – 13

Цель занятий 11–13: Изучение эмульгирующей активности углеводородокисляющих штаммов.

Определение показателей синтеза ПАВ

Определение эмульгирующей активности. В качестве гидрофобной фазы для эмульгирования используют жидкие парафины (например, гексадекан), керосин, легкую нефть (плотность 0,80 г/см3), рапсовое и соевое масло. К 5 мл исследуемого раствора, содержащего ПАВ (культуральная жидкость, супернатант культуральной жидкости, клеточная суспензия) добавляют 5 мл эмульгируемого субстрата и встряхивают в течение 2 мин. Измерение индекса эмульгирования (Е24) определяют через 24 часа, как величину отношения высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в пробирке (выражают в процентах). Для получения супернатанта культуральной жидкости ее центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Клеточную суспензию получают при суспендировании осадка клеток в дистиллированной воде, объем которой равен объему исходной культуральной жидкости, из которой были осаждены клетки [21].

Для получения культуральной жидкости бактерии рода Rhodococcus выращивают в жидкой среде следующего состава (г/л): KNO3 – 1,0; NaCl – 1,0; Na2HPO4 – 0,6; KH2PO4 – 0,14; MgSO4 · 7H2O – 0,1; рН – 6,8–7,0 [21].

Штаммы рода Pseudomonas культивируют на среде следующего состава (г/л): K2HPO4 · 3H2O – 2,0; KH2PO4 – 1,2; NaNO3 – 3,0; MgSO4 · 7H2O – 0,5; pH – 6,8–7,2 [11].

В качестве источника углерода и энергии в указанные среды добавляют гекасадекан – 2 % (по объему).

Культивирование проводят на круговой качалке (180 об/мин) в течение 168 часов.

Определение нефтеотмывающих свойств культуральной жидкости. Для этого на стеклянную пластинку (4 × 2 см) наносят тонкий слой тяжелой нефти (плотность 0,99 г/см3), затем пластинку опускают на 1 час в исследуемый раствор, содержащий ПАВ (культуральную жидкость), после чего определяют площадь чистой, отмытой от нефти, поверхности стекла. Нефтеотмывающие свойства рассчитывают как отношение площади отмытого от нефти стекла к общей площади и выражают в процентах [21].

Занятие 11

Задание 1. Исследовать эмульгирующюю активность культуральной жидкости штаммов нефтеокисляющих бактерий. Для этого приготовить указанные среды в колбах по 30 мл и отдать на стерилизацию.

Занятие 12

Задание 1. Для посева использовать 1–2-суточные культуры. Поместить колбы на круговую качалку (180 об/мин) и культивировать 7 суток при 30 °С.

Занятие 13

Задание 1. Определить индекс эмульгирования (Е24) по методике, приведенной выше.

Задание 2. Исследовать нефтеотмывающие свойства культуральной жидкости по методике, приведенной выше.

Тема 4. ИЗУЧЕНИЕ ГИДРОФИЛЬНО-ГИДРОФОБНЫХ СВОЙСТВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

Занятия 14 – 15

Цель занятий 14–15: Изучение гидрофильно-гидрофобных свойств углеводородокисляющих бактерий.

Тест на гидрофобность основан на определении степени адгезии клеток в 0,1 моль/л растворе NaCl к каплям углеводорода (н-гексадекана) [17]. Исследуемые штаммы бактерий выращивают в периодических условиях на качалке при 30 °С на среде Барнетт с 0,5 % глюкозы, глицерина, н-гексадекана. В опыты берут клетки ранней стационарной фазы роста – после 18 часов культвирования. Клетки отмывают от среды и концентрируют 3-х кратным центрифугированием в 0,1 моль/л растворе NaCl. Концентрацию микробных клеток в дисперсионной среде определяют на ФЭК (длина волны 540 нм, кювета с рабочим шагом 0,5 см). Исходная концентрация клеток – D = 0,6 ед. опт. плотности. Показатель гидрофобности микробных клеток (Г, %) рассчитывают по соотношению:

, (3)

Где Do – оптическая плотность исходной микробной дисперсии, D –оптическая плотность дисперсии после взаимодействия клеток с углеводородной фазой и расслоения эмульсии при отстаивании.

Клетки с гидрофильной поверхностью характеризуются низкими величинами Г в отличие от клеток с гидрофобной поверхностью.

Занятие 14

Задание 1. Засеять колбы с жидкой средой Барнетт суспензией односуточной культуры и поместить на круговую качалку.

Занятие 15

Задание 1. Определить показатель гидрофобности клеток исследуемого штамма, руководствуясь выше приведенной методикой.

Тема 5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ШТАММОВ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЩИХ БАКТЕРИЙ

Занятия 16 – 18

Цель занятий 16–17: Исследование морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств штаммов углеводородокисляющих бактерий и их идентификация до уровня рода.

Морфолого-культуральные признаки

Определяют форму клеток, характер соединения клеток в агрегаты, размер и подвижность вегетативных клеток, способность окрашиваться по Граму.

Для выявления спорообразования используют метод пастеризации, для этого 10- и 20-ти суточные культуры выдерживают на водяной бане в течение 30 минут при температуре 80 °С. Затем производят посев на скошенный РПА. О наличии спор свидетельствует появление роста.

Изучают особенности роста штаммов на плотных и жидких средах.

Изучение физиолого-биохимических свойств

Способность использовать углеводы и многоатомные спирты исследуют на среде следующего состава (%): пептон – 0,5; K2HPO4 – 0,1. Среду разливают в пробирки по 5 мл, на дно каждой пробирки опускают поплавок и стерилизуют при 1 атм. Углеводы и многоатомные спирты готовят в виде 10 %-ных водных растворов, стерилизуют при 0,5 атм. Затем добавляют к основному фону среды в таком количестве, чтобы конечная концентрация сахара (спирта) в среде составляла 1 %. Оценивают способность штаммов использовать арабинозу, ксилозу, рамнозу, глюкозу, галактозу, фруктозу, лактозу, маннозу, мальтозу, сахарозу, сорбозу, трегалозу, раффинозу, декстрин, инулин, глицерол, дульцит, инозит, сорбит, салицин и др.

Среды засевают и инкубируют в термостате при 30 °С. Если изучаемый микроорганизм развивается быстро, то результаты регистрируют через 48–96 часов, а если медленно – через 7–10 суток. Чтобы обнаружить изменение рН, к среде добавляют индикатор бромкрезолпурпур из расчёта 2 мл 1,6 %-ного спиртового раствора на 1 л среды. При рН 6,8 индикатор имеет пурпурный цвет, а при рН 5,2 – желтый. О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке.

Образование ацетилметилкарбанола (АМК). Этой способностью обладают микроорганизмы, сбраживающие глюкозу с образованием кислот, которые в дальнейшем участвуют в биосинтезе нейтральных продуктов – ацетилметилкарбинола (ацетоина), диацетила и 2,3-бутиленгликоля. Способность образовывать АМК определяют на среде Кларка следующего состава (%): глюкоза – 1,0; пептон – 0,5; К2НРО4 – 0,1. Среду разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 0,5 атм. Посевы культивируют в течение 7–10 суток. АМК обнаруживают по реакции Фогес-Проскауэра, которая основана на том, что в щелочных условиях ацетоин окисляется в диацетил, реагирующий с гуанидиновой группой аргинина, содержащегося в пептоне. Вследствие этого образуется комплексное соединение, окрашенное в красный цвет. Для обнаружения АМК используют следующие методики:

1. К 3 мл культуральной жидкости добавляют 1 мл свежеприготовленного 10 %-ного спиртового раствора a-нафтола и 1мл 20 %-ного водного раствора КОН, хорошо перемешивают. При положительной реакции появляется красное окрашивание.

2. К 5 мл культуральной жидкости добавляют 5 мл 40%-ного раствора КОН, тщательно перемешивают. Реакционную смесь оставляют на 24 часа при комнатной температуре. При наличии ацетоина развивается красное окрашивание.

Тест Хью-Лейвсона (тест на окисление – брожение). Тест для определения того, метаболизируется ли данный углевод (обычно глюкоза) путем окисления или путем сбраживания. Применяют среду следующего состава (%): пептон – 0,2; NaCl – 0,5; K2HPO4 – 0,03; агар-агар – 0,3; бромтимолблау (водорастворимый) – 0,003; глюкоза – 1. Культуру засевают в четыре пробирки, две из которых заливают после этого 2–3 мл стерильного 1,5%-ного водного агара для создания анаэробных условий. Если бактерии не способны к анаэробной ферментации глюкозы, то зелёный цвет индикатора не меняется в пробирках со средой, залитых 1,5%-ным водным агаром. Если бактерии способны окислять глюкозу до кислоты, то цвет индикатора меняется в жёлтый от поверхности в глубину среды.

Способность к денитрификации определяют на среде следующего состава (г/л): глицерин – 10,0; дрожжевой экстракт – 5,0; (NH4)2SO4 – 2,0; KNO3 – 10,0; K2HPO4 – 2,0; MgSO4 · 7H2O – 0,025; NaCl – 0,5; FeSO4 · 7H2O – 0,001; агар – 1,0. Среду разливают в пробирки по 5 и 10 мл и стерилизуют при 0,5 атм. Исследуемый микроорганизм вначале засевают в пробирки с 5 мл среды (1-й пассаж). Посев делают уколом. Через 24 часа культуры 1-го пассажа переносят в пробирки с 10 мл среды, которые предварительно расплавляют и охлаждают до 40–45 °С. После внесения культуры среду перемешивают, остужают и заливают 2-3 мл 1%-ным водным агаром. Посевы инкубируют в термостате при 30 °С. Рост бактерий, способных к денитирификации, сопровождается помутнением среды и выделением газа.