. Репликация генома (стр. 17 )

Несмотря на присутствие d-субъединицы в субкомплексе g3dd’, он не может в отсутствие АТФ вызывать размыкание b-колец, необходимое для их погрузки на ДНК. Однако в присутствии АТФ комплексы g3dd’ служат эффективными погрузчиками. Это позволило предположить, что в отсутствие АТФ в комплексе g3dd’ субъединица d’ маскирует N-концевой клин субъединицы d, не давая ему взаимодействовать с поверхностью b-кольца. В присутствии АТФ конформация всего комплекса изменяется, он переходит в более открытую форму, в которой субъединица d становится доступной для взаимодействия с b-кольцом. Изучение кристаллической структуры комплекса g3dd’ подтвердило эту гипотезу.

В петамерном кольцевом комплексе g3dd’ индивидуальные субъединицы расположены по кругу в следующем порядке: …d’-g1-g2-g3-d… (рис. 1.19, А). С-концевые домены III всех субъединиц участвуют в их ассоциации в пентамер. Ассоциация обеспечивается встраиванием a-спирали первого партнера каждой пары в гидрофобную щель между двумя a-спиралями следующего партнера. По 3-мерной структуре комплекс g3dd’ похож на кисть правой руки, сложенную в щепоть (рис. 1.19, В). Соединенные С-концевые домены всех субъединиц соответствуют ладони, а домены I и II вместе взятые –пальцам (субъединица d’ – большой палец, три смежные субъединицы g1, g2 и g3 - указательный, средний и безымянный пальцы и субъединица d - мизинец).

Рис. 1.1900. Трехмерная структура комплекса погрузчика скользящего зажима ДНК-полимеразы III E. coli.

А – вид сверху, В – вид сбоку (в неактивном состоянии в отсутствие связанного АТФ), С – взаимодействие N-концевой области субъединицы d с кольцом субъединицы b

Можно предположить, что в отсутствие АТФ комплекс g3dd’ находится в «закрытой» конфигурации, в которой кончики «пальцев» тесно прижаты друг к другу. В этом состоянии N-конец субъединицы d’ маскирует в субъединице d участок клина BIE, взаимодействующего с b-кольцом, и комплекс g3dd’ не может вызывать размыкание кольца. При взаимодействии с АТФ происходит постепенный переход комплекса в открытую конфигурацию, обусловленный изменением коформации всех субъединиц, за исключением d’, которая играет роль конформационно стабильного статора в погрузчике зажима. Три молекулы АТФ связываются только с 3 субъединицами g и, вероятно, в строго определенном порядке. Вначале АТФ взаимодействует только с субъединицей g1, т. к. только на стыке d’-g1 домен связывания АТФ в субъединицах g открыт для АТФ. Образование комплекса g1-АТФ вызывает характерные для белков ААА+ конформационные изменения на стыке g1-g2 при участии сенсорных доменов, открывающие для связывания АТФ домен I в g2 и т. д. Связывание АТФ с последней АТФазной субъединицей g3 вызывает изменение конформации в белке d, N-концевой домен которого спасается от секвестрирования смежной субъединицей d’. Это придает комплексу g3dd’ способность ассоциироваться с b-кольцом и раскрывать его по одной из контактных границ между мономерами. Таким образом, при раскрывании b-кольца АТФ необходим только для изменения конформации комплекса g3dd’.

Эти события соответствуют переходам из состояния “a” в состояние “c” на общей схеме погрузки скользящего зажима на ДНК (рис. 1.20). Комплекс g3dd’ в отсутствие b-кольца имеет очень низкое сродство к ДНК независимо от присутствия АТФ. Однако в присутствии белка b он приобретает способность связываться с ДНК, предпочитая стыки затравка-матрица. По-видимому, после открывания b-кольца через щель между мономерами субъединицы b внутрь кольца пропускается нить онДНК на таких стыках, и комплекс g3dd’ прикрепляется к ДНК (cостояние “d”). Взаимодействие с ДНК по неустановленному механизму активирует АТФазую активность g-субъединиц и вызывает переход по меньшей мере двух из них в форму комплекса с АДФ. Смена партнера в АТФазных центрах этих субъединиц узнается их доменами сенсор-2 и приводит к развитию в комплексе g3dd’ обратных конформационных изменений, возращающих g3dd’ в исходную замкнутую конфигурацию. N-концевой сегмент BIE субъединицы d покидает поверхность b-кольца, которое смыкается на ДНК (состояние “e”). Комплекс g3dd’ освобождается от погруженного зажима, а последующее освобождение АДФ возвращает его в исходное состояние “a”. Цикл погрузки b-кольца на этом заканчивается (состояние “e”). Погрузка b-кольца сопровождается гидролизом АТФ, энергия которого израсходовалась на регенерацию замкнутой формы погрузчика.

Рис. 1.20. Последовательные этапы погрузки b-кольца скользящего зажима ДНК-полимеразы III E. coli на праймированную ДНК

Литература

1.  «Гены», М., Мир, 1987, с. 396-431.

2.  Brush G. S., Kelly T. J. Mechanisms for replicating DNA // In “DNA Replication in Eukariotic Cells”, Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1996, pp. 1-43.

3.  Alberts B. DNA replication and recombination // Nature, v. 421, 431-435, 2003.

4.  Bollum F. J. Therminal deoxynucleotidyl transferase // In “The Enzymes”, v. 10, p.145-171, 1974.

5.  Marians K. Prokaryotic DNA replication // Ann. Rev. Biochem., v. 61, 673-719, 1992.

6.  Joyce C. M. Polymerase structures and function: variation on a theme? // J. Bacteriol., v. 177, 6321-6329, 1995.

7.  Steitz T. A. DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms // J. Biol. Chem., v. 274, 17398\5-17398, 1999.

8.  Brautigam C. A., Steitz T. A. Structural and functional insights provided by crystal structures of DNA polymerases and their substrate complexes // Curr. Opin. Structural Biol., v. 8., 54-63, 1998.

9.  Jäger J., Pata J. C. Setting a grip: polymerases and their substrate complexes // Curr. Opin. Structural Biol., v. 9., 21-28, 1999

10.  Patel P. H., Suzuki M., Adman E., Shinkai A, Loeb L. A. Prokaryotic DNA polymerase I: evolution, structure, and “base flipping” mechanism for nucleotide selection // J. Mol. Biol., v. 308, 823-837, 2001 .

11.  ДНК-полимеразы эукариот // Мол. биол., т. 33, 567-580, 1999.

12.  Stuckl M., Stagljar I., Jonsson Z. O., Hűbscher U. A coordinated interplay: proteins with multiple functions in DNA replication, DNA repair, cell cycle / checkpoint control, and transcription // Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., v. 65, 261-299, 2001.

13.  Hűbscher U., Maga G., Spadari S. Eukaryotic DNA polymerases // Ann. Re. Biochem., v. 71, 000-000, 2002.

14.  Budd M. E., Campbell J. I. Interrelationships between DNA repair and DNA replication // Mutat. Res., v. 451, 241-255, 2000

15.  Foiani M., Lucchini G., Plevani P. The DNA polymerase a - primase complex couples DNA replication, cell cycle progression and DNA damage response // Trends Biochem. Sci., v. 22, 424-427, 1997

16.  Burgers P. M.J. Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and repair // Chromosoma, v. 107, 218-227, 1998.

17.  Burgers P. M.J., Koonin E. V. et al. Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised nomenclature // J. Biol. Chem., v. 276, 43487-43490, 2001.

18.  Aravind L., Koonin E. V. Phosphoesterase domains associated with DNA polymerases of. different origins // Nucl. Acids Res., v. 26, 3746-3752, 1998.

19.  Cahn I. K.O., Ishino Y. Archaeal DNA replication: identifyng the pieces to solve a puzzle // Genetics, v. 152, 1249-1267, 1999.

20.  Hingorani M. M., O’Donnell M. Sliding clamps: a (tail)ored fit // Curr. Biol., v. 10, R25-R29, 2000.

21.  Tsurimoto T. PCNA, a multifunctional ring on DNA // Biochem. Biophys. Acta, v. 1443, 23-39, 1998.

22.  Lopes de Saro F. J., O’Donnell M. Interaction of the b sliding clamp with MutS, ligase and DNA polymerase I // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 98, 8376-83802, 2001.

23.  Dalrymple B. P., Kongsuwan K., Wijffels G., Dixon N. E., Jennins P. A. A universal protein-protein interaction motif in the eubacterial DNA replication and repair systems // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 98, 11627-11632, 2001.

24.  Mossi R., Hűbscher U. Clamping down on clamps and clamp loader. The eukaryotic replication factor C // Eur. J. Biochem., v. 254, 209-216, 1998.

25.  Trakselis M. A., Benkovic S. J. Intricacies in ATP-dependent clamp loading: variation across replication systems // Structure, v. 9, 999-1004, 2001.

26.  Ellison V., Stillman B. Opening of the clamp: an intimate view of an ATP-driven biological machine // Cell, v. 106, 655-660, 2001.

27.  Neuwald A. F., Aravind L., Spouge J. L., Koonin E. V. AAA+: a class of chaperone-like ATPases associated with assembly, operation, and disassembly of protein complexes // Genome Res., v. 9, 27-43, 1999.