. Репликация генома (стр. 29 )

Таким фактором оказался белок SeqA длиной 181 остаток, несущественный для жизнеспособности клеток. В мутанте seqA метилирование вновь синтезированной ДНК oriC задержано не на 13 мин, а всего на 5 мин, в результате чего значительно нарушается синхронность репликации на множественных oriC. Белок SeqA преимущественно связывается с гемиметилированными, а не с полностью метилированными и неметилированными 13-мерами в oriC, в начале каждого из которых расположен сайт GATC. Из двух сайтов связывания SeqA в области 13-меров наиболее сильный расположен в 13-мере L. Белок SeqA связывается с этими гемиметилированными сайтами с большим сродством, чем метилаза Dam. К тому же SeqA имеет более высокую концентрацию в клетках, чем Dam, и не смещается с ДНК в присутствии Dam. Поэтому связывание SeqA с областью 13-меров защищает ДНК oriC от метилирования под действием Dam. Такое связывание приводит также к временной ассоциации области Dam c внешней мембраной клетки, поскольку белок SeqA может вести себя как мембранный белок. Связывание с мембраной не зависит от присутствия на ДНК oriC белка DnaА. Однако связывание SeqA с ДНК нестабильно, и через 10 мин связанный белок SeqA диссоциирует от ОНР oriC и делает её доступной для метилирования под действием метилазы Dam. Это приводит к восстановлению полностью метилированного состояния ДНК oriC, благоприятного для инициации.

Второй мишенью для секвестрирования при участии белка SeqA является промоторная область гена dnaA, кодирующего сам белок-иницатор. Она содержит не только блоки oriC, но и один сайт GATC, который после прохождения репликации также надолго задерживается в гемиметилированном состоянии из-за связывания с ним SeqA. Это вызывает временное ингибирование инициации транскрипции гена dnaA и препятствует увеличению концентрации белка DnaA в клетке. На том же уровне работают ещё два механизма предотращения несвоевременной инициации репликации в ОНР oriC.

·  Pегуляция уровня свободного белка DnaA

Белок DnaA связывается с узнаваемыми им блоками DnaA не только в oriC и в гене dnaA, но и в ещё ~300 cайтах хромосомы E. coli. Эти сайты имеют имеют разное сродство к DnaA и конкурируют с oriC за связывание инициатора, понижая концентрацию свободного белка DnaA в клетке. Среди 5 областей хромосомы E. coli, имеющих наиболее высокое сродство к DnaA, особое положение занимает локус datA, расположенный на 95-ой мин хромосомы и реплицирующийся вскоре после инициации репликации на oriC. Этот локус длиной 950 п. н. содержит 4 блока DnaA, т. е. примерно столько же, как и ОНР oriC и соседний ген mioC, но может оттитровывать в 8 раз больше белка DnaA (300-400 молекул DnaA in vivo). Он неспособен секвестрироваться при участии SeqA, т. к. содержит очень мало сайтов GATC. Сразу после репликации локуса datA, которая происходит примерно в момент окончания секвестрирования oriC, количество связанного с ним белка DnaA удваивается, что приводит к значительному понижению внутриклеточного уровня свободного DnaA на следующем этапе клеточного цикла. Улавливание DnaA локусом datA существенно для регуляции инициации репликации хромосомы. Удаление datA из хромосомы вызывает избыточную инициацию, а повышение числа копий datA в клетке полностью выключает инициацию репликации на oriC. Однако перенос локуса datA в другие положения хромосомы не нарушает функцию datA, так что ранняя репликация datA несущественна для контроля инициации.

·  Регуляция активности белка DnaA

Сборка скользящих зажимов b-субъединиц ДНК-полимеразы III при инициации репликации на oriC запускает так называемый механизм RIDA регуляторной инактивации DnaA – гидролиз АТФ в активной форме DnaA-АТФ и переход белка-инициатора в неактивную форму DnaA-АДФ. Гидролиз АТФ ускоряется b-субъединицей PolIII и ещё одним недостаточно охарактеризованным белком IdaB. Этот механизм понижает “потенциал репликации”, как только был запущен раунд репликации хромосомы. Однако он недостаточен для предотвращения реинициации в отсутствие секвестрирования oriC и титрования локусом datA.

Период полураспада комплексов DnaA с АТФ или АДФ in vitro одинаков и составляет ~ 1 час. Однако если связанный с ДНК белок DnaA инкубировать в присутствии анионных фосфолипидов, ассоциированные с DnaA нуклеотиды освобождаются очень быстро, и DnaA, утративший связанный АДФ, приобретает способность связывать АТФ и возвращаться в активную форму DnaA-АТФ. Белок DnaA очень часто связывается с клеточной мембраной и взаимодействует в ней с анионными фосфолипидами. Это способствует накоплению комплекса DnaA-АТФ к моменту инициации следующего раунда репликации. Отсутствие в клетке анионных фосфолипидов вызывает неспособность инициировать репликацию хромосомы из oriC.

Таким образом, три разных механизма предотвращают преждевременную реинициацию и вносят вклад в запуск репликации в определенный момент клеточного цикла. Однако пока не доказано, что сочетания только этих механизмов достаточно для строгой регуляции инициации репликации хромосомы E. coli.

3.2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

3.2.1. Области начала репликации (ОНР) ARS и комплекс узнавания ОНР (ORC)

У S. cerevisiae были идентифицированы специфические элементы хромосомной ДНК, названные автономно реплицирующимися последовательностями ARS (autonomously replicating sequences). Встраивание этих элементов в кольцевые плазмидные ДНК обеспечивает автономную репликацию плазмид в клетках дрожжей. С использованием метода двумерного гель-электрофореза, позволяющего обнаружить репликативные пузырьки ДНК, было показано, что элементы ARS совпадают с сайтами начала двунаправленной репликации ДНК как в содержащих ARS плазмидах, так и в самих дрожжевых хромосомах. Таким образом, последовательности ARS являются функциональными ОНР хромосомной ДНК S. cerevisiae. Эти свойства дрожжевых ОНР значительно облегчили их изучение.

В 16 хромосомах S. cerevisiae содержатся от 250 до 400 ОНР. Все изученные элементы ARS у дрожжей, имеющие модульную структуру, состоят из доменов А и В и имеют длину 100-150 п. н. (рис. 3.5). Домен А содержит консенсусную последовательность, названную ACS (ARS consensus sequence). Элемент ACS длиной 11 п. н. имеет первичную последовательность (A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T), являющуюся существенной для инициации репликации. Даже одиночные замены нуклеотидов в ACS могут устранить активность ARS. Тем не менее, некоторые известные ARS, содержащие одну и даже две измененные пары нуклеотидов по сравнению с ACS, являются эффективными ОНР. С другой стороны, не каждая последовательность ACS в геноме проявляет активность ОНР в отсутствие других доменов ARS.

Домен В в ARS состоит из 3 элементов. Ближайший к ACS элемент В1 образует вместе с ACS сайт связывания белкового комплекса узнавания ОНР. Богатый остатками А и Т элемент В2 выполняет функцию элемента расплетания ДНК DUE. Репликация ДНК в прототипной хромосомной ОНР ARS1 инициируется примерно посередине между сегментами В1 и В2. Элемент В3 в некоторых ARS связывает фактор транскрипции Abf1 и играет роль вспомогательного элемента AUX, обеспечивающего оптимальную эффективность инициации репликации. Элементы доменов В в различных элементах ARS у дрожжей гораздо менеее консервативны, чем домен А. Наиболее консервативным из них является элемент В1.

В прототипный элемент ARS1 иногда включают и третий домен С, расположенный по другую сторону от ACS и упакованный в уникально позиционированную нуклеосому. Эта нуклеосома, вероятно, понижает вероятность упаковки смежного сайта ACS в другую нуклеосому, которая могла бы подавить активность ARS1.

C последовательностью ACS и смежным сегментом В1 в дрожжевых ARS на протяжении почти всего клеточного цикла связан белковый комплекс узнавания ori (ORC – origin recognition complex). Общее количество комплексов ORC в одной клетке примерно соответствует числу ARS. Этот комплекс состоит из 6 белков, кодируемых существенными генами ORC1-ORC6. Аналогичные комплексы ORC имеются у всех эукариотов (табл. 4.1). Три субъединицы комплекса (Orc1, Orc4 и Orc5) содержат сайты связывания нуклеотидов, как у ДНК-зависимых АТФаз, и относятся к семейству АТФаз ААА+. Самая большая субъединица Orc1 может гидролизовать АТФ in vitro, но в присутствии ДНК ARS гидролиз АТФ предотвращается. По-видимому, как и в случае белка DnaA, связанный АТФ играет в ORC роль аллостерического эффектора, требующегося для специфической ассоциации с последовательностями ДНК ARS, а гидролиз АТФ идет на более поздних стадиях инициации репликации.

AAATTTCGAAAAATGCT AAGAAATAGGTTAGTACTGAGTAGT

B3

ATTTATTTAAGTATT GTTTGTGCACTTGCCTG CAAGGGCCTTTT

B2

GAAAAGCAAGCAT AAAAGATC TAAACATAAAA TCTGTAAAATAACA

B1 ACS

сайт связывания комплекса ORC

Рис. 3.5. Организация прототипной области начала репликации ARS1

S. cerevisiae.

Изогнутыми стрелками отмечены сайты инициации двунаправленной репликации хромосомной ДНК. Приведена последовательность комплементарной нити сайта ACS

Таблица 3.1

Сравнение субъединиц комплекса ORC из разных эукариотов