. Репликация генома (стр. 3 )

1 – инцизия поврежденного участка нити ДНК эксцизионными эндонуклеазами, 2 – расплетание сегмента нити ДНК между ОР ДНК-геликазой и освобождение этого сегмента из дуплекса, 3 – репаративный ресинтез однонитевой бреши ДНК.

I – эксцизионная эндонуклеаза, II – ДНК-геликаза, III – ДНК-полимераза

Репликация ДНК состоит, как правило, в образовании двух дочерних копий днДНК всех компонентов генома (хромосом и эписом или плазмид). При репликации синтезируются две новые нити, комплементарные нитям родительского дуплекса ДНК. В результате каждый родительский дуплекс замещается двумя дочерними, состоящими из одной родительской и одной вновь синтезированной нитей. Репликация является полуконсервативной, т. к. консервативными единицами являются одиночные нити родительской днДНК. Главные ДНК-полимеразы, на долю которых приходится большая часть репликативного синтеза ДНК, иногда называют ДНК-репликазами. Остальные ДНК-полимеразы играют вспомогательную роль в репликации ДНК и/или участвуют в репаративном синтезе. Их иногда называют репаративными ДНК-полимеразами, но этот термин не является строгим.

Процесс репликации состоит из трех последовательных стадий: инициации (начала синтеза ДНК) , элонгации (ростьа цепи ДНК) и терминации (окочанияокончания синтеза). Репликация обычно начинается в одном или многих специфических сайтах генома, которые называются областями начала репликации (ОНР, или ori от origin). Область, в которой репликация ДНК останавливается, называется область окочанияокончания репликации (terminus). Эти контрольные элементы определяют единицу репликации ДНК, называемую репликоном. Первой существенной стадией в инициации репликации является локальное раскрывание (расплетание) двойной спирали ДНК, дающее ДНК-полимеразам доступ к одиночным матричным нитям ДНК. Сами ДНК-полимеразы неспособны вызывать раскрывание дуплекса во внутренних участках, хотя при репаративном синтезе со смещением нити могут проявлять ограниченную способность расплетать расположенную перед ними днДНК на ОР или однонитевых брешах. Существование специализированных ОНР повышает эффективность репликации ДНК, создавая места для сборки состоящих из многих белков комплексов репликативного синтеза ДНК, или реплисом. В сборке этих комплексов важную роль играют специфические ДНК-белковые и белок-белковые взаимодействия. Первичное открывание дуплекса ДНК обычно вызывается специфическим белком-инициатором, обладающим способностью узнавать нуклеотидную последовательность ОНР. Оно облегчается особенностями структуры ДНК ОНР (например, негативной суперспирализацией ДНК или присутствием в ОНР «легкоплавких» участков ДНК) и некоторыми вспомогательными белками (например, связывающими онДНК белками типа SSB).

Первичное раскрывание дуплекса создает предпосылки для образования репликативной вилки (точки ДНК, в которой комплементарные нити расходятся и дают ДНК-полимеразам возможность синтезировать ДНК). В установлении репликативной вилки важную роль играет погрузка на разошедшиеся нити ДНК-геликаз – ферментов, использующих энергию гидролиза НТФ для однонаправленной транслокации по нити ДНК и плавления дуплекса. На некоторых ОНР погрузка ДНК-геликазы осуществляется на обе разошедшиеся нити. Это приводит к образованию двух репликативных вилок, перемещающихся по дуплексу ДНК в разных направлениях, так что репликация ДНК является двунаправленной. На других ОНР устанавливается только одна репликативная вилка, и начинается однонаправленная репликация.

В отличие от РНК-полимераз, ДНК-полимеразы и обратные транскриптазы не могут инициировать синтез ДНК de novo, т. е. синтезировать первый динуклеотид из двух дНТФ. Они нуждаются для инициации в затравке, или” праймере” (primer). Во время репаративного синтеза ДНК-полимеразы элонгируют уже установившуюся нить ДНК, свободный 3’-OH-конец которой и служит затравкой. Роль праймера в репликации ДНК обычно играют короткие цепи РНК. Лишь некоторые фаговые и вирусные ДНК-полимеразы (например, у фага f29 Bacillus subtilis или аденовирусов) могут использовать для инициации репликации белковые праймеры, в которых боковые гидроксильные группы остатков тирозина, серина или треонина играют такую же роль акцептора дНТФ, как 3’-OH-группа на конце полинуклеотидной цепи. Ретровирусы могут использовать в качестве затравки для инициации обратной транскрипции готовые природные тРНК клеток хозяина. В остальных случаях затравки РНК необходимо синтезировать de novo. Наиболее часто синтез праймеров катализируется специальным классом ДНК-зависимых РНК-полимераз, так называемыми праймазами. Однако у бактерий иногда (например, при инициации репликации некоторых плазмид) затравка РНК может синтезироваться обычной РНК-полимеразой. У эукариотов в синтезе митохондриальной ДНК также участвует не стандартная праймаза, а митохондриальная РНК-полимераза. Праймазы вовлекаются в инициацию новых цепей ДНК геликазами, расположенными в репликативных вилок. Образовавшийся комплекс, содержащий геликазу и праймазу, называется праймосомой.

В зависимости от частоты и распределения событий синтеза праймеров процессы репликации ДНК разделяются на непрерывные и полунепрерывные. При непрерывной репликации комплементарные нити дочерней ДНК синтезируются по-очереди (рис. 1.5, А). Вначале образуется праймер для копирования нижней нити родительского дуплекса. ДНК-полимераза элонгирует этот праймер, ведя синтез со смещением верхней родительской нити до конца матрицы нижней нити. Затем происходит независимая репликация смещенной матрицы верхней нити, инициированная второй затравкой. Так реплицируются по механизму вращающегося кольца ДНК некоторых фагов и бактериальных плазмид и эукариотическая митохондриальная ДНК, а также молекулы линейной ДНК аденовирусов.