Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 11 )

Значение титрования без липазы (время реакции “0”) вычитают из величины последующих титрований. В этом случае полученные графики пройдут через начало координат, поскольку так учитывается наличие органических и желчных кислот в молоке (исходная кислотность молока) до начала действия липазы.

Пример графика зависимости содержания свободных ВЖК от времени инкубации:

Схема определения

I. Приготовление исходной смеси (в стаканчиках)
Реактивы и этапы	Стаканчик 1	Стаканчик 2
1. Разбавленное (1:1) молоко   2. Вода   3. Желчь	10 мл - 1 мл	10 мл 1 мл -
II. Определение исходной кислотности молока
Колба для титрования 1	Колба для титрования 2
1. Исходная смесь (отбирают аликвоту из стаканчика в колбочку для титрования) 2. Фенолфталеин (добавляют в каждую  колбочку)   Титруют пробы раствором NaOH (до розового цвета). Значения записывают в таблицу результатов (V0  и V0 ’).	2 мл 1-2 кап	2 мл 1-2 кап

III. Отбор смеси и титрование в присутствии липазы
К оставшейся исходной смеси в оба стаканчика быстро добавляют по 1мл липазы и отмечают время. Через 5 мин отбирают аликвоты в колбы для титрования
Колба для титрования 1	Колба для титрования 2
1. Аликвота  2. Фенолфталеин   Быстро титруют раствором NaOH (до розового цвета). Значения записывают в таблицу результатов (V  и V ’)   Повторные титрования проводят через каждые 5 мин и результаты заносят в следующую таблицу.	2 мл 1-2 кап	2 мл 1-2 кап

Оформление результатов

V(NaOH),  мл t, мин	проба № 1 (с желчью)	проба № 2 (без желчи)
V	V-V0	V’	V’-V0 ’
0 (определение исходной кислотности молока)	V0 =	0	V0 ’=	0
5	V =	V’=
10
15
20
по получен-ным  данным строят кинетическую кривую № 1	по получен-ным  данным строят кинетическую кривую № 2

Выводы

Занятие 14.

14.1. Семинар: «Расчёт энергетического эффекта распада высших жирных кислот и глицерина».

Используя пример расчёта баланса энергии в учебнике (, , издание третье, с 376 -377) проведите расчёт количества АТФ, образующегося при окислении молекул:

А) стеариновой кислоты

Б) олеиновой кислоты

Г) пальмитиновой кислоты

14.2. Лабораторная работа: «Определение ацетоновых тел в моче».

К ацетоновым телам относятся ацетон, в-гидроксимасляная кислота и ацетоуксусная кислота.

В норме моча млекопитающих животных и человека содержит незначительные количества ацетоновых тел, которые не выявляются обычными химическими реакциями. Повышенное выделение ацетоновых тел с мочой наблюдается при нарушении жирового или углеводного обмена, при голодании и неправильном режиме питания.

Для обнаружения веществ, которые в моче здорового человека и животных не встречаются в аналитически определяемых количествах (белки, глюкоза, кетоновые тела, билирубин и гемоглобин) можно использовать экспресс-методы полуколичественного анализа (так называемые, тест-полоски).

Цель работы

Провести экспресс-тесты с 5 образцами мочи. Определить рН каждого из образцов, а также содержание белка, кетоновых тел, глюкозы. Проанализировать полученные результаты.

Принцип метода

О концентрации того или иного реагента можно судить по изменению окраски сенсорной зоны, сопоставив полученный результат с соответствующей цветной шкалой на упаковке.

Сенсорная или реакционная зона любой тест-полоски (для определения глюкозы, кетонов, белка, нитритов, билирубина, уробилиногена и т. д.) представляет собой некую матрицу, в которой находится много различных сбалансированных химических компонентов. Наряду с химическими компонентами в некоторые сенсорные зоны тест-полосок  вводят ферменты, специфически взаимодействующие с определяемым веществом в пробе. Тест-полоски с наличием ферментов в сенсорной зоне называют ферментативными.

Чтобы результаты определения были корректными, определение необходимо проводить в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией по применению.

Реагенты, используемые в сенсорной зоне

№ п/п	Анализируемое соединение	Рабочий реагент
1	белок	Эфир тетрабромфенолфталеина, тетрабромфеноловый синий
2	глюкоза	Глюкозооксидаза, пероксидаза, тетраметилбензидин
3	кетоновые (ацетоновые) тела	Натрия нитропруссид
4	рН	Метиловый красный, бромтимоловый синий

Примечание:

Проба, анализируемая на наличие белка, наиболее чувствительна к альбумину, значительно менее чувствительна к глобулинам, мукопротеинам, гемоглобину. На определение белка не влияет величина рН мочи, но в сильно щелочной моче (рН выше 8) или в моче с высокой буферной емкостью тест может дать ложноположительные результаты. Не обращайте внимания на окраску сухой зоны.

Определение глюкозы основано на ферментативной (глюкозоксидаза/пероксидаза) реакции, тест специфичен для глюкозы, другие сахара не взаимодействуют. Реакция не зависит от рН и присутствия кетоновых тел.

Кетоны - проба значительно чувствительнее к ацетоуксусной кислоте, чем к ацетону. С бета-гидроксимасляной кислотой проба не реагирует. Лекарственные и диагностические препараты на основе фенолфталеина, присутствующие в моче, могут в щелочной среде зоны окрашиваться в красный и даже пурпурный цвет. Цветная шкала сравнения на этикетке отражает концентрацию ацетоуксусной кислоты в моче.

Выполнение работы

Тест-полоску опускают на 1-2 с. в исследуемый образец так, чтобы сенсорные зоны были смочены. Капли мочи с полоски удаляют, проведя полоской по краю сосуда с мочой. Полоску оставляют в горизонтальном положении. Приблизительно через 60 с. сопоставляют окраску зон индикации с соответствующей цветной шкалой.

Оформление работы

I  обра-зец	II обра-зец	III обра- зец	IV обра- зец	V обра- зец
рН
Белок
Глюкоза
Кетоновые тела

Выводы

fРаздел 8e

Обмен простых и сложных белков.

Белковому обмену принадлежит особое место среди других видов обмена веществ. Это объясняется выполнением белками специфических функций, которые не могут заменить ни углеводы, ни липиды: пластической, каталитической, иммунной.

Белки направляют и регулируют обмен веществ, создавая оптимальные условия для их собственного воспроизводства в живых системах. Исключение белка из клрма животных не столько сказывается на уменьшении массы органов и ткани, сколько в снижении активности ферментов, замедлении биосинтеза белка.

Поскольку белки всех организмов отличаются строгой видовой и тканевой специфичностью, организм человека и моногастричных животных использует белки пищи только после их полного гидролиза до АМК в желудочно-кишечном тракте под действием ряда протеолитических ферментов – петидаз. Все пептиды в зависимости от места расположения гидролизуемой пептидной связи делятся на:

1) эндопептидазы, гидролизующие пептидные связи, удалённые от концов пептидной цепи: пепсин, трипсин, химотрипсин, эластаза.

2) экзопептидазы, гидролизующие пептидые связи, образованные N - и C-концевыми аминокислотами: аминопептидаза, карбоксипептидаза, дипептидаза.

Желудочные и панкреатические пептидазы вырабатываются в неактивной форме, секретируются  в месте действия, где активируются путём частичного протеолиза. Такой механизм образования активных ферментов необходим для защиты секреторных клеток желудка и поджелудочной железы от самопереваривания.

Переваривание белков в желудке происходит под действием пепсина. Профермент пепсиноген вырабатывается главными клетками слизистой желудка и при поступлении пищи секретируется в полость желудка. Пепсиноген активируется двумя способами:

1) соляной кислотой (медленно);

2) аутокаталитически (быстро) уже имеющимся пепсином

Желудочный сок содержит соляную кислоту, которая вырабатывается обкладочными клетками желудка и выполняет следующие функции:

1) оказывает бактерицидное действие;

2) вызывает частичную денатурацию белков пищи;

3) создаёт оптимум рН для пепсина;

4) активирует пепсиноген путём частичного протеолиза

Переваривание белков в кишечнике моногастричных животных происходит под действием:

1) ферментов поджелудочной железы: трипсина, химотрипсина, эластазы, карбоксипептидаз;

2) ферментов тонкой кишки: аминопептидаз, дипептидаз, трипептидаз.

Активная форма трипсина образуется в кишечнике при участии энтеропептидазы, которая отщепляет от N-конца трипсиногена гексапептид, что приводит к изменению конформации молекулы и формированию активного центра трипсина.

Остальные протеазы панкреатического сока: химотрипсиноген, прокарбоксипептидаза, проэластаза – активируются трипсином.

Активация панкреатических пептидаз происходит по каскадному механизму. Кишечные пептидазы синтезируются в энтероцитах сразу в активной форме.

Конечным результатом переваривания белков является образование свободных АМК, поступающих в клетки слизистой оболочки кишечника путём активного транспорта.

Переваривание белков жвачных животных происходит в основном в рубце, где осуществляется распад практически всех белков под действием ферментов бактерий (в основном, стрептококков) и  простейших (инфузорий).

Большая часть свободных АМК, образующихся в результате переваривания белков, используется для синтеза собственных белков организма, часть  на синтез биологически активных молекул: гормонов, биогенных аминов, а также нуклеотидов, гемма, креатинфосфата и многих других соединений, в том числе глюкозы в процессе глюконеогенеза.

Важнейший путь превращения АМК в организме – это реакции трансаминирования с б-кетокислотами с образованием новых (заменимых) АМК.

Ещё один путь метаболизма – декарбоксилирование АМК с образованием биологически активных молекул – биогенных аминов. Основным коферментом обмена АМК является пиридоксальфосфат (ПФ).

Деградация АМК происходит путём их дезаминирования: безазотистые остатки могут использоваться для синтеза глюкозы (глюконеогенез) или, превращаясь в ацетил-КоА, окисляться до углекислого газа и воды с образованием энергии (различаю гликогенные и кетогенные АМК).

В организме человека и животных ежесуточно распадается до аминокислот (АМК) около 400 г белков и столько же синтезируется. Основным источником АМК для человека являются пищевые белки. Суточная норма потребления белков для человека составляет около 100 г. Все 20 АМК, которые входят в состав белков организма, можно разделить на заменимые (синтезируемые самим организмом) и незаменимые (не синтезируются и должны поступать с пищей). Присутствие в пищевых белках всех незаменимых АМК определяет полноценность белкового питания человека и животных.

При недостаточном содержании бека в корме животного, неполноценном по аминокислотному составу, а также при заболеваниях желудочно-кишечного тракта происходит снижение его роста, замедление развития, нарушение репродуктивных функций, снижается сопротивляемость к инфекциям, а у сельскохозяйственных животных наблюдается снижение молочной и мясной продуктивности.

Вопросы для внеаудиторной теоретической работы по разделу: