Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 5 )

1) оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции.

2) трансферазы – осуществляют межмолекулярный перенос различных химических групп.

3) гидролазы – расщепляют внутримолекулярные связи гидролитическим путём.

4) лиазы – катализируют реакции негидролитического распада веществ или присоединения групп по двойным связям и отщепления групп с образованием двойных связей.

5) изомеразы – участвуют в реакциях изомеризации.

6) лигазы (синтетазы) – ускоряют реакции соединения двух молекул, сопряжённые с расщеплением макроэргической связи в молекуле АТФ или аналогичного нуклеозидтрифосфата.

Лабораторный практикум в рамках этой темы охватывает изучение специфических фермент-субстратных отношений (амилаза – крахмал), а также определение активности ферментов в биологических жидкостях (амилазы в моче крупного рогатого скота)

Вопросы для внеаудиторной теоретической работы по разделу:

1) Биологические катализаторы: рибозимы и ферменты. Понятие о ферментах, их роль в обмене веществ. Химическое строение ферментов. Понятие о коферментах, связь коферментов с витаминами.

2) Кинетика ферментативных реакций, механизм действия ферментов. Специфичность действия ферментов. Регуляция активности ферментов. Аллостерические эффекторы, активаторы и ингибиторы ферментов.

3) Индукция и репрессия ферментов. Понятие о проферментах и изоферментах. Общие принципы определения активности ферментов. Единицы активности ферментов.

4)  Международная классификация и номенклатура ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы (синтетазы).

5) Применение ферментов в медицине, ветеринарии, пищевой промышленности и сельском хозяйстве.

Занятие 5.

5.1. Семинар по теме «Ферменты»

1. Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-).

Специфичность действия сложных ферментов определяется коферментом. Активный центр фермента состоит из субстрат-связывающего и каталитического участков. Активность фермента не зависит от концентрации субстрата. Скорость ферментативной реакции всегда увеличивается с увеличением рН среды. Пепсин обладает абсолютной специфичностью действия. Всегда ли происходит образование фермент-субстратного комплекса в процессе ферментативной реакции? Зависит ли скорость ферментативного процесса от количества присутствующего фермента? Влияют ли ионы тяжелых металлов на активность фермента? Можно ли разделить ферменты методом высаливания сульфатом аммония? Известны ли ферменты, обладающие стереоспецифичностью действия?

2.Вопросы с выборочным ответом

Обратимость ферментативной реакции зависит от: температуры ионной силы раствора термодинамического состояния системы концентрации фермента структуры активного центра

К классу оксидоредуктаз не относится фермент: каталаза пероксидаза амилаза аскорбатоксидаза лактатдегидрогеназа

5.2 Лабораторная работа: «Действие амилазы на крахмал».

Фермент амилаза (α-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ: 3.2.1.1) осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы. Последняя под влиянием фермента мальтазы расщепляется на две молекулы глюкозы. В слюне содержатся амилаза и мальтаза, так что слюна способна расщеплять крахмал до глюкозы.

Основным источником амилазы в организме человека является поджелудочная железа, секретирующая фермент в кишечник, где происходит расщепление поступающего с пищей крахмала.

Цель работы

Определить время полного расщепления крахмала амилазой слюны.

Принцип метода

Нерасщепленный крахмал с иодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от размера молекул, дают с иодом последовательно фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску, тогда как мальтоза и глюкоза окрашивания с иодом не дают. Таким образом, можно наблюдать за скоростью расщепления крахмала по реакции с иодом. Активность амилазы в слюне не имеет большого физиологического значения и может значительно отличаться у разных людей.

Выполнение работы

В 9 пробирок наливают по 2 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 капле 1% раствора иода. Отдельно в стаканчик наливают 5 мл 0,5% раствора крахмала. Из стаканчика берут пробу - 1 каплю, вносят в первую пробирку и перемешивают, в результате чего раствор в пробирке окрашивается в синий цвет. В стаканчик быстро вносят 5 капель слюны, энергично перемешивают и замечают по секундомеру время. Через 20 секунд берут из стаканчика пробу – 1 каплю и вносят во вторую пробирку. Если жидкость в пробирке станет фиолетовой или красной, то пробы из стаканчика нужно отбирать и вносить в пробирки через каждые 20 секунд. Если жидкость в пробирке № 2 окрасится в синий цвет, то пробы следует отбирать через более длительные интервалы времени, например через  1 минуту. Когда в одной из пробирок цвет раствора иода не изменится, гидролиз крахмала считают законченным. Фиксируют время, затраченное на полное расщепление крахмала. Результаты опыта записывают в виде таблицы:

№ пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Окраска жидкости

Выводы

Занятие 6.

6.1 Семинар «Ферменты» (продолжение)

1. Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-)

Связано ли действие некоторых лекарственных препаратов с ингибированием отдельных ферментов? Все ферменты состоят из субъединиц. Константа Михаэлиса выражается в единицах концентрации субстрата. Изоферменты катализируют одну и ту же химическую реакцию. Первая цифра в шифре фермента обозначает, к какому классу он относится. Осуществляют ли лигазы расщепление соединений по двойным связям? Существуют ли мультиферментные комплексы? Изменяется ли константа Михаэлиса в присутствии конкурентного ингибитора? Всегда ли ингибирование фермента необратимо? Используют ли препараты очищенных ферментов в терапевтических целях?

2.Вопросы с выборочным ответом

Фермент, не относящийся к гидролазам: амилаза трипсин каталаза холинэстераза пепсин

Конкурентные ингибиторы: повышают КМ фермента понижают КМ фермента повышают Vmax понижают Vmax не изменяют КМ и Vmax

6.2. Лабораторная работа: «Определение активности амилазы в моче крупного рогатого скота» по Вольгемуту.

       α-Амилаза (К. Ф. 3.2.1.1) – фермент, катализирующий гидролитическое расщепление 1,4-α-гликозидных связей в молекулах крахмала и гликогена.

       В организме человека основными источниками α-амилазы являются поджелудочная железа и слюнные железы, в которых существует 2 семейства изоферментов амилазы, соответственно P и S.

       Изоферменты P – образуются только в поджелудочной железе. Изоферменты S – преимущественно в слюнных железах, а также в других органах и тканях. Доля изоферментов P в общей активности α-амилазы значительно выше в моче, чем в сыворотке крови.

       Резкое (в 10-30 раз) повышение содержания (и соответственно активности) α-амилазы в сыворотке крови и в моче наблюдается при остром панкреатите (в первые сутки).

Цель работы

Определить активность α-амилазы в моче и сравнить с нормой.

Принцип метода

       Существует много разных методов определения активности α-амилазы. Мы познакомимся с простым и надежным методом последовательных разведений фермента, предложенным еще в 1929 г. Вольгемутом и сохранившемся до настоящего времени. Метод основан на определении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала (отсутствие цветной реакции с иодом) при заданных условиях.

Выполнение работы

Получение последовательных разведений мочи: в 6 пробирок наливают по 1 мл 0,85% раствора NaCl. В первую пробирку вносят 1 мл мочи (тщательно перемешивают). 1 мл смеси из первой пробирки переносят во вторую, перемешивают. 1 мл из второй пробирки переносят в третью пробирку и т. д. Из последней пробирки, после перемешивания, 1 мл выливают в раковину. В результате получают ряд последовательных разведений мочи:1:2; 1:4; 1:8;1:16 и т. д.

№ пробы	1	2	3	4	5	6
Разведение	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Окраска
Чем обусловлена окраска

Во все пробирки быстро вносят по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляют по 1 капле 1% раствора йода и тщательно перемешивают. Окраску раствора в пробирках заносят в таблицу.

       Отмечают последнюю пробирку, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание с иодом) и рассчитывают активность α-амилазы.

Расчет активности α-амилазы

       За условную единицу активности (ед. Вольгемута) принимают активность необходимую для расщепления 1 мл 0,1% раствора крахмала при комнатной температуре за 30 мин.

А = 2 . Р [ед. Вольгемута]

2 (мл) – объем 0,1% крахмала

Р – разведение (см. таблицу), например 1-я пробирка – разведение 2,

6-я пробирка – разведение 64.

Норма: от 16 до 64 условных единиц Вольгемута.

Выводы

f Раздел 4e

Витамины

Витамины – низкомолекулярные органические соединения различной химической структуры (изопреноиды, производные пиримидина, птеридина и др.), которые не синтезируются в организме человека и животных и относятся к незаменимым факторам питания. Иными словами, витамины - эссенциальные (жизненно важные) факторы питания, необходимые для протекания разнообразных химических процессов в организме.

Витамины отличаются от других органических соединений: они не входят в структуру тканей и не используются в качестве источника энергии. Не все витамины, необходимые для человека, необходимы для животных. Так например, витамин С  (аскорбиновая кислота) необходим для человека, приматов и морских свинок, а кролики, крысы и некоторые другие животные могут самостоятельно его синтезировать.

При недостаточном поступлении витаминов с пищей в организм, а также при полном отсутствии их в пище, либо при нарушении их всасывания развиваются тяжёлые заболевания – авитаминозы.

Гиповитаминозом считают недостаточное поступление витаминов или неполное их  усвоение, гипервитаминозом – избыточное потребление витаминов. Гипервитаминозы встречаются реже, чем гиповитаминозы, и это состояние наблюдается чаще всего при избыточном поступлении витаминов А, D, К. Причины гипо - и авитаминозов у человека и животных делят на экзогенные и эндогенные.

Таблица. Причины гипо - и авитаминозов у человека и животных

Экзогенные причины	Эндогенные причины
недостаточное поступление витаминов полное отсутствие витаминов в пище	дефицит витаминов вследствие повышенного расходования витаминов при заболеваниях, связанных с нарушением всасывания их в желудочно-кишечном тракте; дефицит витаминов при заболеваниях печени; возрастающее потребление витаминов при некоторых физиологических состояниях (беременность, лактация, тиреотоксикоз и др.); нарушение транспорта и метаболизма витаминов (превращение в кофермент)

Современная классификация витаминов основана на физико-химических свойствах (в частности, на растворимости).

По растворимости витамины подразделяются на жирорастворимые (А, D, E и К) и водорастворимые (В1, В2, В3, Вс, В6, В12, РР, Р, Н, С). В химическом отношении жирорастворимые витамины А, D, E и К относятся к изопреноидам, водорастворимые витамины (группы В, витамин С, витамин Н) содержат разнообразные химические структуры. Наиболее сложную химическую структуру имеет витамин В12 (цианокобаламин).

Помимо перечисленных витаминов, в организме человека и животных синтезируется группа соединений, обладающих витаминными свойствами (витаминоподобные вещества): холин, липоевая кислота, оротовая кислота, витамин U, карнитин и др.