Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 3 )

2.2.  Лабораторная работа: «Цветные реакции на белки и аминокислоты».

Белки — полимерные соединения, построенные из аминокислот, которые соединены между собой пептидными связями. Аминокислоты – производные карбоновых кислот, у которых три валентности α-углеродного атома всегда образованы одним атомом водорода (—H), аминогруппой (—NH2) и карбоксильной группой (—COOH). Четвертая валентность может быть образована одним атомом водорода (—Н у глицина) или группировкой атомов, называемой радикалом аминокислот (—R). В составе радикалов многие аминокислоты имеют реакционно-способные (функциональные) группы. Например:

1. Сульфгидрильная группа (—SH) у цистеина.

2. Тиометильная группа ( —S–CH3) у метионина.

3. Гидроксильная группа (-ОН) у серина, треонина и тирозина.

Цель работы

Провести цветные реакции с двумя растворами (I и II)1, один из которых содержит овальбумин (яичный белок), а другой – желатину (овальбумин содержит все 20 аминокислот, а желатина только 17), и определить, в каком растворе содержится овальбумин, а в каком – желатина.

Принцип метода

Ряд химических реактивов специфически взаимодействуют (реагируют) с функциональными группами аминокислот (как свободных, так и в составе пептидов или белков) в результате чего развивается специфическое окрашивание. Такие реакции называют цветными реакциями. Интенсивность окраски в цветных реакциях пропорциональна количеству реагирующих функциональных групп. Поэтому цветные реакции могут быть использованы для качественного и количественного определения белков, для определения присутствующих в них аминокислот или для анализа состава белков.

Так, например:

биуретовой реакцией определяют наличие пептидных групп в олигопептидах и в белках (универсальная для любых белков). нингидриновой реакцией определяют наличие α-аминогрупп в свободных аминокислотах, а также в аминокислотах олигопептидов и белков (универсальная для любых белков). ксантопротеиновой реакцией определяют наличие в белках  ароматических аминокислот. реакцией Фоля определяют наличие в составе белков серосодержащей аминокислоты – цистеина.

Студенты проводят указанные цветные реакции на 4-х предметных стеклах:

На один край каждого стекла наносят 1 каплю раствора I, на другой – раствора II

. Методики выполнения работы на предметных стёклах:

Биуретовая реакция. К белкам на первом стекле последовательно добавляют 1 каплю 10% NаOH и 1 каплю 1% CuSO4, аккуратно перемешивая стеклянной палочкой.

Нингидриновая реакция. К белкам на втором стекле добавляют 1 каплю раствора нингидрина. Перемешивают. Осторожно нагревают до кипения.

Ксантопротеиновая реакция. К белкам на третьем стекле добавляют 1 каплю концентрированной HNO3. Перемешивают. Осторожно нагревают.

Реакция Фоля. К белкам на четвертом стекле добавляют 1 каплю 30% NaOH и 1 каплю (CH3OO)2Pb. Нагревают до кипения.

Выполнение работы в пробирках

Реакция	№ пробирок	Ход определения для реакций, протекающих в пробирках	Окраска	Чем обусловлена реакция
Биуретовая	1	Раствор I—5 капель, 10% NaOH—5 капель, 1 % CuSO4—1 капля
2	Раствор II —5 капель, 10% NaOH—5 капель, 1 % CuSO4—1 капля
Нингидри- новая	1	Раствор I—5 капель, 1% раствор нингидрина в ацетоне—2 капли, нагревают
2	Раствор II —5 капель, 1% раствор нингидрина в ацетоне —2 капли, нагревают
Ксанто-протеиновая	1	Раствор I—5 капель, конц. HNO3—3 капли, осторожно нагревают
2	Раствор II—5 капель, конц. HNO3—3 капли, осторожно нагревают
Фоля	1	Раствор I—5 капель, 30 % NaOH—5 капель, 5 % (CH3COO)2Pb—1 капля, нагревают до кипения
2	Раствор II—5 капель, 30 % NaOH—5 капель, 5 % (CH3COO)2Pb—1 капля, нагревают до кипения

Выводы

Заполнить таблицу, сравнить полученные окраски, определить, в каком растворе овальбумин, а в каком – желатина и обосновать этот выбор.

        f Раздел 2 e

Нуклеиновые кислоты. Нуклеопротеины.

Нуклеиновые кислоты - это высокомолекулярные соединения, построенные из большого числа мононуклеотидов, обладающие сложной пространственной структурой и осуществляющие хранение и реализацию наследственной информации

Мононуклеотиды состоят из трёх компонентов: пуринового или пиримидинового азотистого основания, углеводного компонента (пентозы) - рибозы или дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты (см. схему ниже).

Пиримидиновые азотистые основания – это производные гетероциклического азотсодержащего соединения – пиримидина, пуриновые азотистые основания рассматривают как производные конденсированного гетероциклического азотсодержащего соединения - пурина. К пиримидиновым азотистым основаниям относятся урацил (У), тимин (Т), цитозин (Ц), к пуриновым – аденин (А), и гуанин (Г).

Дезоксирибоза, входящая в состав ДНК, отличается от рибозы только тем, что в её молекуле у второго углеродного атома гидроксильная группа замещена водородом.

Схема строения мононуклеотида

Соединения, состоящие из азотистого основания, соединённого с пентозой (рибозой или дезоксирибозой) называются нуклеозидами.

  Составные компоненты нуклеиновых кислот

Рибонуклеотиды	Дезоксирибонуклеотиды
Азотистое основание	А, Г, Ц, У	А, Г, Ц, Т
Пентоза	рибоза	дезоксирибоза
Фосфорная кислота	+	+

Отдельные мононуклеотиды в молекуле нуклеиновой кислоты соединяются между собой посредством кислородных мостиков за счёт гидроксильной группы третьего углеродного атома пентозы одного мононуклеотида и гидроксила фосфорной кислоты соседнего нуклеотида (образуется так называемая 3′,5′-фосфодиэфирная связь). Соединённые мононуклеотиды образуют, таким образом, полинуклеотидную полимерную цепь. В различной последовательности расположения нуклеотидов и заключается, по существу, кодирование наследственной информации.

Азотистые основания и соответствующие им нуклеозиды или мононуклеотиды нуклеиновых кислот

Азотистое основание	Нуклеозид	Мононуклеотид
А (аденин)	Аденозин	Адениловая кислота,  или аденозинмонофосфат (АМФ)
Г (гуанин)	Гуанозин	Гуаниловая кислота, или гуанозинмонофосфат (ГМФ)
Ц (цитозин)	Цитидин	Цитидиловая кислота, или цитидинмонофосфат (ЦМФ)
У (урацил)	Уридин	Уридиловая кислота, или уридинмонофосфат (УМФ)
Т (тимин)	Тимидин	Тимидиловая кислота, или тимидинмонофосфат (ТМФ)

Структурные компоненты нуклеиновых кислот (нуклеотиды) входят в состав коферментов (НАД+, ФАД, КоА), являются макроэргическими соединениями (АТФ, УТФ, ЦТФ, ГТФ, ТТФ) и вторичными мессенджерами (цАМФ, цГМФ).

Нуклеопротеины представляют собой сложные белки, состоящие из простого белка и небелковой части – нуклеиновой кислоты. Нуклеопротеины составляют основную часть клеточного ядра. Они легко выделяются из тканей, богатых ядерным веществом (зобной железы, семенников, сперматозоидов и др.). Они являются не только структурными элементами клетки, её ядра и цитоплазмы, но и выполняют важнейшие специфические функции в живом организме. Деление клеток, биосинтез белков, передача наследственной информации тесно связаны с нуклеопротеинами, в частности с входящими в их состав нуклеиновыми кислотами.

В данном разделе предлагается осуществить разделение высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений методом диализа.

Вопросы для внеаудиторной теоретической работы по разделу:

1) Химия и обмен нуклеиновых кислот.  Представления о химическом строении и структуре нуклеиновых кислот.

2) Расщепление и всасывание нуклеиновых кислот  в желудочно-кишечном тракте. Представление о  биосинтезе пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Матричный механизм синтеза нуклеиновых кислот. 

3) Распад нуклеиновых кислот в тканях организма. Конечные продукты распада пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов у разных видов сельскохозяйственных животных. Нарушения обмена пуриновых оснований.

4) Биосинтез белка, основные его этапы. Фолдинг  белковых  молекул. Посттрансляционная  модификация белков.

5) Взаимосвязь процессов обмена  веществ в организме.

Занятие 3.

3.1. Семинар по темам: «Нуклеиновые кислоты. Структура ДНК и РНК и их биологическая роль»

Тестовые задания по теме: «Сложные белки и нуклеиновые кислоты»

1.Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-).

Простетическая группа нуклеопротеинов представлена нуклеиновыми кислотами. Углеводы не могут быть простетической группой сложных белков. Фосфорная кислота в фосфопротеинах присоединяется к гидрокисльным группам серина, треонина или тирозина. Протамины и гистоны входят в состав нуклеопротеинов. Миоглобин относится к хромопротеинам. Может ли происходить разрыв водородных связей при денатурации белка? Являются ли нуклеиновые кислоты полинуклеотидами? Отличаются ли молекулы дезоксирибозы и рибозы количеством атомов углерода? Входят ли нуклеопротеины в состав вирусов? Относятся ли флавопротеины к классу хромопротеинов? В молекуле гемоглобина два типа различных субъединиц. В нуклеотидах остаток рибозы присоединяется к азотистому основанию. Ферритин является гемопротеином. В оксигемоглобине железо двухвалентно. В состав молекулы РНК входит тимин. Псевдоуридин - это минорное азотистое основание. Могут ли сложные белки выполнять каталитические функции в организме? Являются ли гликозаминогликаны (мукополисахариды) сложными белками? Связана ли серповидно-клеточная анемия с изменением первичной структуры гемоглобина? Есть ли свободная метильная группа в молекуле тимина?

2.Вопросы с выборочным ответом