Активность ЛДГ в сыворотке крови возрастает у больных, страдающих анемией, опухолями лейкозами, лимфомой, гепатитами, обтурационной желтухой, циррозами печени, заболеваниями почек.

При остром гепатите активность ЛДГ в сыворотке крови увеличена в первые недели желтушного периода. Относительная активность изоферментов ЛДГ-4 и ЛДГ-5 в первые десять суток повышена у всех больных инфекционным гепатитом [Методы клин. лаб. исслед., 2008].

ВЭБ–наиболее значимый представитель герпетических вирусов, способных вызывать клинически выраженный гепатит, а также гепатит с фатальным исходом. Поражение печени, как правило, возникает к пятому дню заболевания и достигает максимальной выраженности к десятому-тридцатому дням. При морфологическом исследовании печени выявляются портальная, перипортальная и синусоидальная лимфомоноцитарная инфильтрация, пролиферация клеток Купфера и желчных канальцев на фоне изолированного или сливного гепатоцеллюлярного некроза и гранулематозного поражения. Печеночные дольки или портальные поля могут быть инфильтрированы мононуклеарными клетками [Вирусы группы герпеса и поражение печени, 2009].

2 Материал и методы исследования

2.1 Материал исследования

2.1.1 Характеристика контингента

Всего было обследовано 40 человек с заболеванием инфекционный мононуклеоз, осложненный вирусом Эбштейн-Барра. Из них 22 человека – мужчины, и 18 человек –  женщины. Возраст больных варьировал от 18 до 35 лет. Контрольную группу составили десять человек, проходившие плановое медицинское обследование.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

2.1.2 Характеристика материала

Биологическим материалом для исследования являлась сыворотка крови.

Забор крови производился в утренние часы, строго натощак. Взятие крови осуществлялось в процедурном кабинете ЛПУ из локтевой вены с соблюдением правил асептики и антисептики. Кровь собиралась в стерильную сухую пробирку, шприц-моновет или вакуумную пробирку. Для получения сыворотки венозная кровь отстаивалась до полного свертывания. После образования фибринового сгустка пробирку центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочная жидкость желтого цвета (сыворотку) осторожно переносилась пипеткой в пустую пробирку с крышкой для дальнейшего исследования.

2.2 Методы исследования

Для верификации инфекционного мононуклеоза проводились биохимические (АЛТ, АСТ, ЛДГ, билирубин) и гематологические исследования, а также эксперсс-тест для выявления гетерофильных антител.

Помимо этих методов в диагностике ИМ используют молекулярно-генетический метод (ПЦР) и иммуноферментный анализ.

Биохимические методы

Биохимические анализы проводились на анализаторе KoneLab 20, производитель Thermo Fisher Scientific. Производительность анализатора составляет 200 тестов в час. При этом первый тест будет готов через 3-12 минут. Дает возможность программировать до 500 различных методик, включая многореагентные, осуществляя, таким образом, и специальные биохимические исследования, в том числе определение концентрации специфических белков, индивидуальных химических веществ и их производных, лекарственный мониторинг, высокочувствительное определение наркотических и веществ и токсинов, а также другие исследования.

2.2.1 Кинетический метод определения активности лактатдегидрогеназы

Принцип: метод основан на ферментативной реакции превращения пирувата в лактат. Лактатдегидрогеназа (L-лактат, НАД-оксидоредуктаза) катализирует превращение лактата в пируват при одновременном восстановлении НАД в НАДН, который далее восстанавливает в присутствии N-метилфеназонийме - тилсульфата йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан. Одновременно с определением общей каталитической активности лактатдегидрогеназы можно определять и долю фермента, устойчивого к действию мочевины, что характерно главным образом для изофермента сердечной фракции. Уменьшение концентрации НАДН пропорционально активности ЛДГ [Ткачук, 2008].

Ход работы: длина волны 340 нм, кювета 1см, температура 37 °С. Определение активности ЛДГ проводят в сыворотке или гепаринизированной плазме крови, без следов гемолиза. Растворы 1 и 2 перед проведением анализа необходимо прогреть приблизительно до 25 °С. В термостатированной кювете смешивают 1 мл раствора 1 и 20 мкл (0,02 мл) пробы биологического материала. Смесь инкубируют 5 минут  при температуре 37 °С. Затем в кювету добавляют  50 мкл (0,05 мл) раствора 2. Замеряют оптическую плотность раствора по отношению к воздуху или воде точно через 60 и 180 секунд с момента добавления в кювету раствора 2.

Расчет: рассчитывалось изменение оптической плотности за 1 мин по формуле (1).

∆А/мин = ( – )/2  (1)

где, ∆А – изменение оптической плотности за одну минуту;

– оптическая плотность через 180 секунд с момента добавления в кювету раствора 2; – оптическая плотность через 60 секунд с момента добавления в кювету раствора 2.

Активность ЛДГ рассчитывали по формуле (2) [Камышников, 2009].

Е/л = ∆А/мин Ч8600  (2)

где, ∆А – изменение оптической плотности за 1 минуту; Е/л – активность ЛДГ.

2.2.2 Кинетический метод определения активности аспартатаминотрансферазы

Принцип: заключается в том, что образовавшийся в результате переаминирования оксалоацетат восстанавливают в малат с одновременным окислением НАДН при действии малатдегидрогеназы и измеряют кинетику оптической плотности НАДН при длине волны 340 нм [Ткачук, 2008]. Скорость окисления НФДН в НАД пропорциональна активности АСТ в пробе [Камышников, 2009].

Ход определения: перед определением температура растворов и сыворотки должна быть доведена до температуры измерения. Перед работой можно готовить смесь реактивов, состоящую из субстратно-буферного раствора, раствора НАДН, МДГ и ЛДГ в соотношении 60: 1: 1: 1. Определение проводят по следующей схеме: перемешивают, и через 60 секунд измеряют экстинкцию и одновременно включают секундомер. Точно через первую, вторую и третью минуту (или через более короткие, но равные промежутки времени) измеряют экстинкцию [Методы клин. лаб. исслед., 2008; Ткачук, 2008].

2.2.3 Кинетический метод определения активности аланинаминотрасферазы

Принцип метода: спектрофотометрическое определение окрашенных продуктов реакции. Аланинаминотрансфераза образует пируват и L-глутамат, катализируя обратимый перенос аминогрупп. Далее ЛДГ образует L-лактат, при этом НАДH переходит в окисленную форму НАД+, что изменяет оптическую плотность раствора при 340 нм. Активность АЛТ зависит от скорости образования НАД+.

Ход определения: к рабочему реагенту добавлялся исследуемый образец в соотношении 10:1. Перемешивался и инкубировался при температуре 37 °С в течение одной минуты. Затем рассчитывались измерения абсорбции с интервалом в одну минуту. Вычислялось среднее изменение абсорбции за одну минуту [Камышников, 2009; Комаров, Коровкин, 1998].

2.2.4 Определение содержания билирубина калориметрическим диазометодом Йендрашика – Клеггорна – Грофа

Принцип метода: при взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая кислота, которая, реагируя со связанным билирубином сыворотки, дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности последнего фотометрически определяют концентрацию общего билирубина. По разнице между содержанием общего и связанного билирубина находят количество свободного.

Ход определения: В три пробирки (для определения уровня общего билирубина, связанного билирубина и постановки контрольной пробы на цвет сыворотки) вносят реактивы согласно табличным данным.

Содержание конъюгированного (связанного) билирубина измерлось спустя  пять-десять минут после добавления диазосмеси. При определении общего билирубина проба оставлялась при комнатной температуре на двадцать минут для развития окраски. В дальнейшем окраска пробы не изменялась. Колориметрировались пробы при длине волны 500 – 560 нм.

Расчет: определение содержания общего и связанного билирубина производилось по калибровочному графику.

Для определения несвязанного билирубина (свободного) из цифры общего его содержания вычитался показатель конъюгированного (связанного) билирубина [Методы клин. лаб. исслед., 2008].

Гематологические методы

Гематологические тесты проводились на анализаторе Sysmex KX-21N, производитель Roche Diagnostics (Швейцария). Материалом исследования являлась венозная и капиллярная кровь. Чувствителен к минимальным изменениям концентраций эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, гемоглобина, эритроцитарных и тромбоцитарных индексов, лимфоцитов, нейтрофилов, смешанных клеток.

2.2.5 Метод подсчета лейкоцитов в камере Горяева

Принцип: основан на подсчете лейкоцитов в 1 мкл крови при постоянном ее разведении и определенном объеме счетной камеры.

Ход определения: в пробирку наливалось 0,4 мл раствора уксусной кислоты, пипеткой на 0,02 мл набиралась кровь и добавлялась в разводящую жидкость. Смесь хорошо перемешивалась. Кровь разводилась в соотношении 1:20.

Чистое и сухое покровное стекло притиралось к камере Горяева так, чтобы появились радужные кольца. Перед заполнением камеры пробирка с разведенной кровью встряхивалась. Концом круглой стеклянной палочки отбиралась разведенная кровь и наносилась на край шлифованного стекла камеры. После заполнения камеры ее оставляли на одну минуту для оседания лейкоцитов. Затем подсчитывались лейкоциты при малом увеличении микроскопа (объектив 8, окуляр 10 или 15) при затемненном поле зрении. Лейкоциты считывались в 100 неразграфленных больших квадратах, что соответствует 1600 малым.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6