Фармацевтическая микробиология Методические указания к лабораторным занятиям для студентов биологического факультета специальности 1-31 01 03 «Микробиология» (стр. 2 )

4. Продуцируют витамины (K, фолиевую кислоту, пиридоксин), расщепляют желчные кислоты, холестерин и координирует его уровень, принимает участие в рециркуляции женских половых гормонов.

5. Оптимизирует процесс пищеварения, моторную функцию кишечника.

6. Способствуют  активизации иммунной системы.

К  микроорганизмам, используемым в качестве пробиотиков, относят:

- лактобактерии (Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. casei, L. lactis, L. reuteri, L. rhamnosus, L. fermentum,, L. gassed);

- бифидобактерии (Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. longum, B. breve, B. adolescents);

- непатогенные разновидности бактерий E. сoli;

- непатогенные спорообразующие бактерии вида Bacillus subtilis;

- непатогенные разновидности бактерий Enterococcus faecium, и Е. saliva-rius;

- бактерии, родов Bifidobacrerium, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococ-cus, синтезирующие в процессе метаболизма молочную кислоту;

- дрожжевые грибки вида Saccharomyces boulardii.

В зависимости от состава различают следующие виды пробиотиков:

Монокомпонентные – содержат только один вид бактерий: Лактобактерин, Бифидумбактерин, Бактолакт, Бактисубтил. Поликомпонентные – включают несколько видов живых микроорганизмов: Линекс, Ацилакт, Лактобациллин,  Энтерожермина.

3. Комбинированные (симбиотики) – содержат как живые бактерии, так и пребиотики (химические вещества, которые содержатся в довольно широком спектре продуктов питания: олигофруктоза, инулин, пантотенат кальция, лактулоза, пектины, декстрин, каротиноиды и др.): Бифилиз, Полибактерин.

Фармакологическая активность препаратов-пробиотиков зависит от количества и состояния входящих в их состав бактериальных клеток. Поэтому количество жизнеспособных клеток в одной терапевтической дозе таких лекарственных средств является одним из основных показателей качества.

Как правило, одна доза лекарственного средства-пробиотика должна содержать не менее 107  живых бактериальных клеток.

Задание 1. Определение количественного содержания живых бактериальных клеток в поликомпонентном пробиотике на основе бактерий.

Определение количественного содержания жизнеспособных клеток, как правило,  проводят следующим способом:

Приготовление серии десятикратных разведений  с учетом предполагаемого титра в готовой лекарственной форме; Посев на соответствующую питательную среду, культивирование, подсчет выросших колоний микроорганизмов и определение тира клеток.

Ход работы

Занятие 1. Определение количества живых клеток бактерий Bacillus  subtilis и Lаctobacillus acidophilus в сухом (лиофилизированном) лекарственном средстве Лактобациллин методом посева на (в) питательные среды.

Испытуемое лекарственное средство:

Лактобациллин, порошок лиофилизированный для приготовления суспензии для приема внутрь 5 доз, во флаконах.

1 доза препарата содержит:

- живых клеток бактерий Lаctobacillus acidophilus – не менее 107;

- живых клеток бактерий Bacillus  subtilis – не менее 107.

Питательные среды и растворы: 

Для количественного определения клеток бактерий Lаctobacillus acidophilus используют стерильное восстановленное молоко.

Для количественного определения клеток бактерий Bacillus  subtilis используют агаризованную среду № 1 (Государственная фармакопея Республики Беларусь – ГФ РБ).

Стерильность и ростовые свойства питательных сред должны быть подтверждены предварительно.

Для приготовления суспензии лекарственного средства и приготовления разведений используют 0,9% изотонический раствор натрия хлорида или стерильную очищенную воду, которые прибавляют из расчета 1 мл на одну дозу препарата (т. е. 5 мл).

Количественное определение живых клеток бактерий Lаctobacillus acidophilus:

Из  полученной суспензии лекарственного средства  готовят серию десятикратных разведений (до 10-9) в пробирках со стерильным  восстановленным молоком. 

Пробирки с инокулятом инкубируют в термостате при температуре  (37±1) °С в течение 72 ч.

Количественное определение живых клеток бактерий Bacillus subtilis:

Из  полученной суспензии лекарственного средства готовят серию десятикратных разведений (до 10-6) в пробирках с 0,9% изотоническим раствором  натрия хлорида или стерильной очищенной водой.

Из двух последних разведений (10-5 и 10-6) делают высевы на среду № 1 (ГФ РБ) по две чашки на каждое разведение. Для этого на поверхность  подсушенной агаризованной среды № 1 в чашках Петри стерильной пипеткой наносят 0,1 мл соответствующего разведения суспензии лекарственного средства и распределяют  стерильным шпателем по всей поверхности среды. Для каждого посева используют новую стерильную пипетку и шпатель.

Чашки переворачивают крышками вниз и инкубируют в термостате при температуре (37±1) °С в течение 24 – 48ч.

Занятие 2. Учет результатов. Анализ соответствия качества испытуемого лекарственного средства по показателю «Количественное  определение живых бактериальных клеток».

По окончании инкубирования проводят учет результатов по макроскопическим признакам роста микроорганизмов.

Для бактерий Lаctobacillus acidophilus отмечают наличие или отсутствие роста микроорганизмов по свертыванию молока в пробирке с определенным разведением.

Количество живых клеток бактерий Lаctobacillus acidophilus в 1 мл (1 дозе) суспензии лекарственного средства определяют по последнему разведению,  в котором обнаружен рост. 

Для бактерий Bacillus subtilis подсчитывают количество выросших колоний на чашках с обоими разведениями. Суммируют результаты параллельных высевов из одного и того же разведения и определяют  среднее количество колоний. При этом учитывают, что оптимальное разведение – разведение, при высеве из которого выросло от 50 до 150 колоний.

Количество живых клеток бактерий Bacillus subtilis в 1 мл (1 дозе) суспензии лекарственного средства вычисляют по формуле:

где: 

М – количество клеток в 1 мл;

а – среднее количество колоний при высеве из данного разведения;

10 – коэффициент разведения;

n – степень разведения;

V – объем суспензии, взятый для посева на чашку Петри (мл).

Результаты заносят в таблицу 1

Таблица 1 

Определение количества живых клеток бактерий Bacillus  subtilis и  Lаctobacillus acidophilus в лекарственном средстве Лактобациллин

Наименование микроорганизма	Количество живых клеток в 1 мл препарата	Критерий приемлемости	Соответствие критерию приемлемости
Lаctobacillus acidophilus	≥ 107
Bacillus subtilis	≥ 107

В заключение делают вывод о соответствии качества испытуемого лекарственного средства по показателю «Количественное  определение живых бактериальных клеток».

Вопросы для подготовки:

Что такое антибиотики и пробиотики? Фармакологические свойства пробиотиков. Требования к микроорганизмам, входящим в состав пробиотиков. Виды пробиотиков. От чего зависит фармакологическая активность пробиотиков? Принцип определения количественного содержания действующих компонентов пробиотиков.

Тема 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ

НЕСТЕРИЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Уровень микробной чистоты – один из основных показателей качества лекарственных средств и фармацевтических субстанций (активных фармацевтических ингредиентов).

Важность микробиологического контроля в фармацевтическом производстве обусловлена ​​последствиями присутствия микроорганизмов как в стерильных, так и в нестерильных ЛС, создающими опасность для здоровья и жизни человека.

Микробиологические требования к качеству нестерильных ЛС вырабатывались в связи с выявлением случаев заболевания людей в результате применения загрязненных микроорганизмами препаратов.

Нестерильные препараты – препараты, в которых допускается содержание живых микроорганизмов, требования к количеству и качественному составу которых зависит от вида и назначения продукции. Нестерильные лекарственные средства составляют ~ 80 % от общего количества лекарственных средств.

Требования к качеству нестерильной  продукции:

- должна содержать ограниченное количество микроорганизмов;

- не должна содержать определенные виды микроорганизмов;

-допустимое количество и виды микроорганизмов зависят от пути введения препарата.

Методы определения микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств и фармацевтических субстанций:

Метод высева на чашки Петри с питательной средой

- метод глубинного посева;

- метод поверхностного посева.

2. Метод мембранной фильтрации

3. Метод наиболее вероятного  числа (наименее точный метод, используется для продуктов с очень низкой бионагрузкой).

Возможность обнаружения микроорганизмов-контаминантов в нестерильном лекарственном средстве должна быть доказана, для чего необходимо провести проверку пригодности используемых питательных сред (стерильность, ростовые, ингибирующие, индикаторные свойства), а также проверку наличия либо отсутствия антимикробного действия лекарственного средства (фармацевтической субстанции). При наличии антимикробного действия оно должно быть надлежащим образом устранено.

Задание 1. Определение микробиологической чистоты нестерильного лекарственного cредства (таблеток, капсул) или фармацевтической субстанции / вспомогательного вещества.

Лекарственные средства в форме таблеток и капсул по способу применения относятся к неводным лекарственным средствам для внутреннего применения.  В соответствии с ГФ РБ (т.1, изд-е 2 раздел 5.1.4.) критерии приемлемости для микробиологической чистоты по содержанию колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г данной группы препаратов следующие:

общее количество аэробов (ОКА) – 103 КОЕ/г; общее количество грибов (ОКГ) – 102 КОЕ/г; отсутствие бактерий Escherichia coli в 1г.

Критерии приемлемости для микробиологической чистоты нестерильных субстанций для производства нестерильных лекарственных средств, а также для вспомогательных веществ следующие: