Фармацевтическая микробиология Методические указания к лабораторным занятиям для студентов биологического факультета специальности 1-31 01 03 «Микробиология» (стр. 3 )

ОКА и ОКГ – 102 КОЕ/г суммарно; Отсутствие Escherichia coli в 1г.

Если в нормативной документации не указано иное, используют  10 г или 10 мл испытуемого продукта, растворяя или суспендируя данное количество в соответствующем растворителе в отношении 1:10.

Метод определения микробиологической чистоты – метод глубинного или поверхностного посева на чашки Петри с питательной средой.

Для определения микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств используют следующие питательные среды:

для выявления ОКА – агаризованную среду на основе гидролизата казеина и соевых бобов  или  агаризованную среду №1; для выявления ОКГ – декстрозный агар Сабуро или  агаризованную среду №2; для выявления бактерий Escherichia coli – бульон на основе гидролизата казеина и соевых бобов, бульон Макконки, агар Макконки.

Ход работы

Занятие 1. Определение микробиологической чистоты (содержания ОКА и ОКГ) нестерильного лекарственного cредства (таблеток, капсул) или фармацевтической субстанции / вспомогательного вещества методом глубинного посева на чашки Петри с питательной средой.

Питательные среды и буферные растворы:

Для приготовления испытуемого образца (лекарственного средства, субстанции / вспомогательного вещества) используют забуференный раствор натрия хлорида и пептона (рН 7,0), или фосфатный буферный раствор (рН 7,2) или бульон на основе гидролизата казеина и соевых бобов.        

Приготовление испытуемого образца:

10 г испытуемого продукта растворяют или суспендируют в 100 мл забуференного раствора натрия хлорида и пептона (рН 7,0) или фосфатного буферного раствора (рН 7,2), или бульоне на основе гидролизата казеина и соевых бобов (разведение 1:10).

Приготовленный образец разводят в 10 раз в пробирках, используя тот же растворитель (разведение 1:100).

Если испытуемый продукт обладает антимикробным действием, его нейтрализуют подходящим способом.

Инокулирование приготовленного образца:

Для определения содержания ОКА и ОКГ используют по  2 чашки Петри для каждого разведения.

Для выявления ОКА: по 1 мл разведения испытуемого продукта 1:10 и 1:100 вносят в 2 чашки Петри  для каждого разведения.  Добавляют ~ 15 мл предварительно расплавленной и охлажденной ~ до 40 – 45°С агаризованной среды №1 или агаризованной среды на основе гидролизата казеина и соевых бобов. Тщательно перемешивают для равномерного распределения образца препарата.

Для выявления ОКГ: по 1 мл разведения испытуемого продукта 1:10 и 1:100 вносят в 2 чашки Петри  для каждого разведения.  Добавляют ~ 15 мл предварительно расплавленной и охлажденной ~ до 40 – 45°С агаризованной среды №2 или декстрозного агара Сабуро. Тщательно перемешивают для равномерного распределения образца препарата.

Отрицательный контроль (проверка на стерильность растворителя и сред).

1 мл растворителя, используемого для приготовления раствора/суспезий испытуемого продукта, вносят в чашку Петри и добаваляют ~ 15 мл предварительно расплавленной и охлажденной ~ до 40 – 45°С соответствующей агаризованной. Тщательно перемешивают для равномерного распределения растворителя.

Чашки Петри предварительно должны быть промаркированы с указанием наименования испытуемого продукта, выявляемых микроорганизмов (ОКА или ОКГ), степени разведения, имени исследователя, даты испытания.

Инкубирование:

После застывания агаризованной среды чашки инкубируют:

в течение 3 – 5 суток при температуре 30 – 35°С для выявления  ОКА; в течение 5 – 7 суток при температуре 20 – 25°С для выявления ОКГ

Занятие 2.  Учет и интерпретация результатов. Анализ соответствия качества испытуемого образца по показателю «Микробиологическая чистота».

По истечении периода инкубирования подсчитывают количество выросших колоний бактерий и грибов. Результаты заносят в таблицы 2 и 3; рассчитывают число КОЕ  (ОКА и ОКГ) в 1г испытуемого продукта и делают вывод о соответствии их содержания установленным критериям приемлемости.

Таблица 2

Определение содержания общего количества аэробов (ОКА)

Разве- дение	ч.№1 число коло ний	ч.№2 число коло ний	Среднее арифметическое числа колоний (а)	*Содержание ОКА, КОЕ/г (Х)	Среднее арифметическое ОКА, КОЕ/г	Критерий приемлемо сти	Соответствие крите рию приемлемости	Отрицательный контроль
1:10	103 КОЕ/г
1:100

Таблица 3

Определение содержания общего количества грибов (ОКГ)

Разве- дение	ч.№1 число коло ний	ч.№2 число колоний	Среднее арифметическое числа колоний (а)	*Содержание ОКГ, КОЕ/г (Х)	Среднее арифметическое ОКГ, КОЕ/г	Критерий приемлемо сти	Соответствие крите рию приемлемости	Отрицательный контроль
1:10	102 КОЕ/г
1:100

*Содержание ОКА и ОКГ (Х) рассчитывается следующим образом:

Х = а · 10n,

где:

а – среднее арифметическое числа колоний для данного разведения;

n – степень разведения испытуемого образца.

Если на агаризованной  питательной среде для выявления бактерий обнаруживаются колонии грибов, они рассчитываются как часть общего количества аэробов (ОКА).

Если на  агаризованной питательной среде для выявления грибов обнаруживается рост колоний бактерий, они рассчитываются как общее количество грибов (ОКГ).

В чашках с отрицательным контролем рост должен отсутствовать.

В заключение делают общий вывод о соответствии качества испытуемого образца по показателю «Микробиологическая чистота» в отношении общего числа аэробов и общего числа грибов.

Вопросы для подготовки:

Чем обусловлена важность микробиологического контроля в фармацевтическом производстве? Какие препараты относятся к нестерильным? Требования к качеству нестерильной фармацевтической продукции. Основные задачи микробиологического контроля нестерильной продукции. Методы определения микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств и фармацевтических субстанций. Критерии приемлемости для микробиологической чистоты неводных нестерильных лекарственных средств для внутреннего применения и средств для кожного и назального использования.

Тема 4. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ

СТЕРИЛЬНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Цель испытания на стерильность – подтверждение полного отсутствия жизнеспособных бактерий и грибов в испытуемом объекте (лекарственном средстве, фармацевтической субстанции).

Испытание применяется для препаратов, которые должны быть стерильны:

лекарственные средства для парентерального применения (растворы, лиофильно высушенные порошки, стерильно расфасованные порошки для инъекций и инфузий); офтальмологические препараты; растворы антисептиков для наружного применения; фармацевтические субстанции, предназначенные для производства лекарственных средств в форме стерильно расфасованных поршков.

Условия для проведения испытания по определению стерильности:

Испытания на стерильность должны проводиться в тех же условиях, что и асептическое производство: при использовании камеры с  ламинарным потоком воздуха класса А, расположенной в чистом помещении класса В, или с помощью изолятора. Подготовка воздуха, подаваемого в чистое помещение, с помощью высокоэффективных фильтров, которые служат для практически полной очистки воздуха даже от самых мельчайших частиц, вплоть до 0.1 мкм. Доступ к помещению должен быть организован через воздушные шлюзы – конструкции с однонаправленными односторонними путями прохождения. Воздушный шлюз предотвращает перемещение воздуха между помещениями. Когда все двери воздушного шлюза закрыты, подаваемый в него воздух разбавляет загрязнения, поступившие из наружного коридора через дверь, либо выделяемые присутствующим персоналом. Испытуемая продукция должна подаваться через передаточные окна. Исполнители должны быть переодеты в стерильную одежду. Исполнители должны пройти соответствующую подготовку. Меры предосторожности, принимаемые против контаминации, не должны влиять ни на один из микроорганизмов, которые могут быть обнаружены входе испытания. Условия, в которых проводятся испытания, должны регулярно контролироваться путем отбора проб воздуха и поверхностей рабочей зоны.

Методы определения стерильности:

Метод прямого посева (инокуляции). Мембранная фильтрация – наиболее предпочтительный метод, если испытуемый препарат фильтруется;

Прямой посев

Преимущества:

- быстрый, простой, экономичный;

- можно испытывать нефильтруемые образцы.

Ограничения:

- ограниченный объем образца: низкая чувствительность;

- проблемы с антимикробным действием.

Мембранная фильтрация

Преимущества:

- возможность удаления антимикробных веществ;

- высокая надежность выявления нестерильности антимикробных препаратов из-за отсутствия разбавления, что имеет место при устранении антимикробного действия;

- возможность фильтрования большого объема;

- статистически более достоверен;

- более чувствителен: высокая эффективность выявления микробной контаминации при низкой концентрации клеток в единице образца благодаря возможности концентрирования или удержания на мембране даже единичных клеток (1 КОЕ на образец).

Ограничения:

- нельзя испытывать нефильтруемые образцы;

- закупоривание мембраны.

Возможность обнаружения микроорганизмов-контаминантов в лекарственных средствах должна быть доказана, для чего необходимо провести проверку пригодности используемых питательных сред (стерильность, ростовые свойства), а также проверку наличия либо отсутствия антимикробного действия лекарственного средства (фармацевтической субстанции). При наличии антимикробного действия оно должно быть надлежащим образом устранено.