«Аутакоидные и гормонально-метаболические предпосылки тренированности у юных спортсменов с различным соматотипом» (стр. 6 )

Реактивы-ацетонитрил  (Sigma, Германия)

К 400 мкл исследуемой  плазмы прибавили ацетонитрил 400 мкл (1:1), положили на лед на 10 мин, затем перемешали на вортекс-шейкере в течение 30 сек, далее центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. После этого произвели забор средней фазы 100 мкл из полученного образца.

Описание ЯМР эксперимента

ЯМР спектры были сняты на спектрометре Varian400 MHz (США), с точной частотой магнитного резонанса протонов 399,85 МГц при температуре 298 К.

Стандартные протонные спектры регистрировались под действием 60-градусного радиочастотного импульса с использованием методики подавлением воды water_ES. Релаксационная задержка составила 15 секунд, регистрация сигнала происходила в течении 2,556 секунд. Ширина спектра составила 6410,3 Гц, что эквивалентно 16 ppm (от -2 до 14 ppm). Объем регистрируемых данных составил 16384 комплексные точки. Все спектры были получены при 256 накоплениях. Непосредственно перед проведением ЯМР эксперимента 250 мкл образца были растворены в 750 мкл 99,9 % D2O.

Water_ESпредставляет из себя сложную импульсную последовательность с использованием целого ряда методик подавления воды (селективное насыщение, T1-фильтр, WATERGATE). Параметры импульсной последовательности для подавления растворителя в каждом образце подбираются автоматически. Идентификация сигналов в спектрах производилась с помощью программного обеспечения Chenomаx.

Исследование в митохондриальной АТФ и в кл АТФ

Методика конфокальной микроскопии клинических образцов

Пробоподготовка

Обработку образца начинали после формирования кровяного сгустка (не ранее, чем через 30 минут и не более 3 часов после забора). Подбор режима центрифугирования осуществляли на скоростях 1500 об/мин в течение 10 минут, 2000 об/мин в течение 10 минут и 3000 об/мин в течение 7,5 минут. Максимальное разделение сыворотки и клеточного осадка наблюдалось при режиме центрифугирования 2000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре.

Клеточный осадок  отбирали по 1 мл в криовиалы объемом (1,8-2,0) мл. Пробы хранили в штативах с крышками, при -20°С, -40°С, -60°С, -80°С до выполнения анализа. При температуре -80°С количество жизнеспособных клеток превышало 25 млн, при более высоких температурах -20°С, -40°С клетки погибали при сроках хранения 1-2 недели и выполнить анализ не представлялось возможным, при температуре -60°С количество жизнеспособных клеток снижалось до 5 млн, что снижает достоверность результатов. Для длительного хранения и коллекционирования образцов был выбран температурный режим -80°С.

Выделение клеток и их подготовка для конфокальной микроскопии

Обработку предварительно подготовленных образцов начинали после размораживания в течение 30 минут при комнатной температуре. Пробу разводили  стерильным 0,2 молярным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) из расчета 5:1. Значение PH буфера составляло 7,8.  Далее центрифугировали образцы на скорости 4000 оборотов в минуту в течение 10 минут при температуре 4°С.  Аккуратно удаляли жидкую фазу механической пипеткой и добавляли 5 мл ФСБ к осадку. Также используя механическую пипетку объемом 1 мл, разводили осадок в ФСБ и доливали ФСБ до 5 мл, далее перемешивали. Далее повторяли процедуру отмывки (центрифугирования образца, удаления жидкой фазы, добавления буфера) при указанных выше параметрах еще 2 раза.

После отмывки лизировали образцы в течение двух часов при температуре - 80°С. Далее, пробу размораживали при комнатной температуре, добавляли до 5 мл ФСБ и центрифугировали на скорости 4000  об/мин в течение 4 минут при температуре 4°С. Удаляли жидкую фазу пипеткой. Для наблюдения внутриклеточного АТФ использовался ATP Bioluminescent Assay Kit (BAK), используемый для количественного определения АТФ в клетках. После подготовительных процедур использовался 96-и луночный плоскодонный культуральный планшет ТРР. Механической пипеткой подготовленные образцы помещались в лунки планшета в объеме 0,1мл и делалась отметка соответствия об их размещении в лабораторном журнале. Согласно инструкции BAK были подготовлен люминицентный реагент, который в объеме 0,1мл смешивался с образцом в лунке. Для каждой серии эксперимента был подготовлен контрольный образец (смесь стандарта АТФ из BAK и ATP AssayMix из BAK в пропорции 1:1 объемом 0,1 мкл, а также образцы калибровочных кривых согласно инструкции BAK. Далее значение интенсивности люминесценции регистрировалось с помощью детектора конфокального микроскопа LSM 700 (CarlZeiss, Германия)

Конфокальный эксперимент

Подготовленный планшет помещался в держатель конфокального микроскопа. Для определения растворенного АТФ пользовались методом конфокальной микроскопии. Готовили препараты из лизированных эритроцитов с использованием набора (ATP BioluminescentAssayKit).  При взаимодействии с АТФ компоненты набора начинали активно люминесцировать. Детекция проводилась в спектре свечения люцеферина желтого (в видимом диапазоне ~500-700 нм) с ожидаемым максимумом около 536 нм.  Данные снимались на конфокальном микроскопе LSM 700 (CarlZeiss, Германия) с использование программного обеспечения  ZENblackMicroscope and Imaging Software (CarlZeiss, Германия). Для анализа каждой лунки данные снимались в нескольких точках. Для построения калибровочной кривой использовались стандарты в разной степени разведения и без него.

Исследование ИЛ-6 и ИЛ-8

Определения содержания цитокинов ИЛ6 и  ИЛ - в сыворотке крови было произведено с помощью метода ИФА в мононуклеарах. Для определения концентрации цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8, в сыворотках крови использовали коммерческие наборы для иммуноферментного анализа фирм Biosource и BenderMedSystems. Результаты анализа учитывали спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Оптическую плотность определяли на приборе Anthos 2020. Калибровочная кривая строилась автоматически по результатам, полученным для стандартов, и по ней определяли содержание определяемого цитокина в исследуемых образцах.

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных была проведена с помощью программного обеспечения Statistica 6. В связи с однородностью групп, исходили из предположения о близости естественного распределения признаков к нормальному и применили методы параметрической статистики. С помощью методов описательной статистики были определены средние значения признаков. Кроме того,  с помощью определения парного критерия Стьюдента были определены достоверные различия между  средними значениями признаками в двух группах. Был проведен корреляционный анализ между признаками в каждой группе у курсантов 4 го и 6го курса. За сильную степень корреляции принимались значения >0,8. Достоверными считались различия при p<0,05.

Глава 4.  Результаты исследования

Среди старших подростков – курсантов 6 курса основная группа (с признаками НДСТ) составила 20 человек, контрольная группа составила также 20 человек. Средний возраст курсантов  составил 16,85 ± 1,02. Средние антропометрические показатели,  а также средние значения результатов нормативов в основной и контрольной группе представлены в таблице 4.1.

4.1 Основная  и контрольная группа. Общая характеристика групп.6 курс.
Таблица 4.1

Основная группа (N= 20)	Контрольная группа (N=20)
Среднее	Ошибка среднего	Среднее	Ошибка среднего
Масса тела (кг)	64, 73	1,80	67,73	1,39
Рост (см)	176,72	1,40	175,81	0,97
ИМТ (вес/рост (м)І)	20,64	0,44	21,91	0,33
ОТ (см)	71,82	1,16	75,22	0,61
ОБ (см)	90,23	0,91	91,24	1,02
ТЖС (см)	0,58	0,04	0,63	0,37
Бег на 1000 м (мин)	3,23	0,02	3,21	0,02
Бег на 100м (сек)	14,07	0,12	13,97	0,11
Подтягивания (кол-во раз)	14.52	0,62	14,31	0,45

Достоверные различия между группами были только при сравнении средних значений показателя окружности талии (71,8±1,16,  75,2±0,61, p= 0,007)  и индекса массы ±0,44, 21.9±0,33,  p=0,015).

4.2 .  Описание корреляционных  связей между показателями в основной и контрольной группе. 6 курс.

4.2.1  Описание сильно коррелирующих показателей ( > 0.8):

В основной группе наибольшие коэффициенты корреляции отмечены между массой тела и окружностью запястья, ИМТ, а также между показателями липидограммы: ХЛС общ, ТГЛ, Хл ЛПНП  и Хл ЛПОНП. Кроме того, сильная  обратная корреляция отмечается между результатами бега на 100 м и количеством подтягиваний.

Наиболее выраженными в этой группе являются:
корреляция между результатом бега на 100 м и количеством подтягиваний,  r= - 0,84 (p<0,001), корреляции между массой тела и окружностью запястья, r= 0,85 (p<0,001), ХЛС общ и Хл ЛПНП r= 0,94 (p<0,001), ТГЛ и Хл ЛПОНП r= 0,95 (p<0,001), между весом и ИМТ, r= 0,84 (p<0,001).

  В контрольной группе  наибольшие коэффициенты корреляции также имеются между весом и ростовыми характеристиками, однако, численные их значения меньше. Так менее выраженной оказалась связь массы тела и окружности запястья, r= 0,61 (p<0,01), а связи между показателями «масса тела» и «ТЖС складки»,  «ОБ» и  «Окружностью запястья»  стали статистически недостоверными. Численно меньше связи показателей ХЛС общ и ХлЛПНП, r= 0,67 (p<0,01).  Кроме того, также были отмечено численно меньшие связи между результатом бега на 100 м и количеством подтягиваний, однако значение данной корреляции оставалось высоким r= - 0,74 (p<0,001). Отмечается появление сильной корреляционной связи между показателями эритроциты и гемоглобин, r=0,91 (p<0,001).  Выявлено появление статистически достоверных обратных корреляций между  «Хл ЛПНП» и «гемоглобин» r= – 0,55 (<0,05), «Хл ЛПНП» и «эритроциты» r= – 0,59 (p<0,05), а также показателями «Индекс атерогенности» и «гемоглобин» r= – 0,57 (р<0,05); «Индекс атерогенности» и «эритроциты» r= – 0,58 (p<0,05).