Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндомиокарда при миокардите (стр. 3 )

  Структура IgG такова, что молекула этого белка состоит из двух легких ( L) и двух тяжелых (H ) полипептидных цепей. Как тяжелые, так и легкие цепи имеют два функционально различных участка или фрагмента - Fv и  Fc.  Fv - это вариабельный участок, отвечающий за связывание с определенным антигеном. Fv легкой цепи и  Fv тяжелой цепи образуют  Fab (fragment antigen binding)- это тот участок молекулы Ig, который  связывается с АГ. Одна молекула Ig G имеет два Fab и может провзаимодействовать с двумя антигенами  детерминантами.  Fc - постоянный участок молекулы Ig,  определяющий видовую специфичность Ig, что весьма важна для иммуногистохимии.

Поликлональные и моноклональные антитела

Схема получения поликлональных антител:

  1) Иммунизация лабораторного животного.

На введенный антиген  в организме кролика вырабатываются антитела. Причем эти антитела могут быть к различным участкам молекулы белка и вырабатываются  различными клонами плазматических клеток. То есть антитела  работают против белка, которым был иммунизирован кролик, но (а) связываются с различными участками этого белка и (б) они различны, так как вырабатываются  разными клонами плазматических клеток и поэтому называются поликлональными.

  2) у иммунизированного животного берут кровь, и, после удаления форменных элементов, поликлональные антитела  могут быть получены из сыворотки путем отчистки последней от других сывороточных протеинов.

  Поликлональные антитела могут быть получены не только из сыворотки крови. Так, Фей с коллегами описал очень оригинальный способ получения большого объема поликлональных антител  путем иммунизации беременных коров. Это процедура безвредна для плода. После удается получить несколько литров молозива, в котором содержание антител в несколько раз превышает их концентрацию в сыворотки крови. Данный метод с успехом используется  для получения большого количества антител к H - антигену сальмонелл, IgG кролика и человека.

Схема получения моноклональных антител:

  Процедура получения моноклональных антител более трудоемкая, но позволяет получить Ig, которые специфично связываются лишь с одним антигеном, и все Ig идентичны по своему строению.

Иммунизация мыши антигеном Выделение из селезенки иммунизированной мыши лимфоцитов и слияние их с клетками плазмоцитами Культивирование гибридом in vitro и отбор нужной гибридомы ( выявление клона, который продуцирует антитела против нужного нам белка. После селекции нужный клон можно хранить  в замороженном состоянии, а антитела этого клона можно получить в больших количествах либо из асцитической жидкости после внутрибрюшного  введения клеток гибридами мышам, либо культивируя клетки гибридами  in vitro.

1.5. Методы выявления комплекса антиген - антитело на гистологических препаратах.

  Для визуализации  мест взаимодействия антител с антигеном необходимо пометить антитела.

(А) Антитела можно «снабдить»  электронно - непрозрачной меткой ( ферритин, коллоидное золото)  и под электронным микроскопом увидеть места локализации антигена.

  (Б) Антитела можно пометить флюрохромом. После образования комплекса антиген – антитело соответствующее место будет светиться при просмотре ультрафиолетовом свете. Однако иммунофлюоресцентный  метод имеет два существенных недостатка:

1) трудность морфологического анализа

2)сложности, связанные с плохой сохранностью  препаратов при их длительном хранении. Эти два недостатка стали определяющими факторами почему большее распространение получил иной подход для визуализации мест локализации комплекса антиген – антитело, который основан на гистохимических реакциях и потому названный иммуногистохимическим.

  (В) В иммуногистохимических методах  в качестве метки выступает фермент, после выявления активности который становятся видны места локализации антигена.

Гистохимические реакции в иммуногистологии

  Иммуногистохимическое окрашивание основано на взаимодействии фермента, которым помечены антитела, с субстратом и образовании окрашенного конечного продукта реакции. Ферменты, которые используют в иммуногистохимии в качестве метки для антитела, должны отвечать ряду требований:

- возможность получения фермента в больших количествах по недорогой технологии

- после коньюгации с антителами фермент не должен терять своей активности

- фермент должен быть стабилен в растворе

-эндогенная активность фермента в тканях не должна быть очень высокой

- конечный продукт  ферментативной реакции должен быть стабильным и хорошо видимым.

  В настоящий момент в иммуногистохимии используют ряд ферментов, которые отвечают вышеперечисленным критериям. Это пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза, бета - галактозидаза и уреаза.

Пероксидаза хрена

  Этот фермент выделен из корня хрена, он расщепляет перекись водорода. Метод выявления активности пероксидазы основан на окрашивании хромогена, который выступает в роли донора электронно, в присутствии перекиси водорода. В качестве хромогена могут быть использованы:

3-диаминобензидин тетрахлорид (ДАБ) – продукт реакции коричневого цвета, нерастворим в органических растворителях, однако требует осторожного обращения, поскольку является канцерогеном.

3- амино-9-этилкарбазол (АЭК)- продукт реакции красного цвета, растворим в спиртах, поэтому окрашивание ядер надо проводить не спиртовыми красителями и заключать срезы лучше всего в глицерин - желатину.

4-хлоро-1-нафтол - конечный продукт синего цвета, растворим в спиртах и других органических растворителях.

П - фенилендиамин дигидрохлорид - продукт реакции темно синего цвета, нерастворим в органических растворителях.

Щелочная фосфатаза

  Методы выявления активности щелочной фосфатазы основаны на использовании искусственных субстратов ( фосфаты нафтолов)  с добавлением в инкубационную среду солей диазония. Локализация фермента после гидролиза субстрата становиться видимой в результате образования из солей диазония  нерастворимых  азокрасителей.

  В качестве субстрата могут быть использованы нафтол АS-MX фосфат,  нафтол AS-BI фосфат, нафтол  AS-TR фосфат или 5- бромо - 4- хлоро-3 – индиксил фосфат. В качестве хромогена можно выбрать следующие красители: прочный красный TR, прочный синий ВВ, «новый фуксин» (New Fuchsin), нитро синий тетразолин.

1.6.  Методы окраски

  Существует много различных методов иммуноферментной окраски, которые позволяют определить место локализации антигена.

  Иммуногистохимия – это один из методов окраски биологических объектов, изучаемых под микроскопом. Их суть заключается в определении локализации антигенов с помощью специфических антител.

Прямой метод

  В случае прямого иммуногистохимического метода используют меченные первичные антитела. Недостатком является то, что продукт гистохимической реакции имеет слабую интенсивность окраски.

Непрямой метод

  Непрямые методы основаны на использовании немеченых первичных антител, которые после связывания с антигеном тканей будут выступать в роли антигена для вторичных ( третичных) конъюгированных с ферментом антител.

Двухшаговый непрямой метод

Первый вариант:

Инкубация с первичными моноклональными ( мышиными) антителами против искомого антигена; промыть в ТБС ( забуференный  физиологический раствор на Трис-НСI буфере pH 7,4), ( три смены по 3мин). Инкубация со вторичными ( против мышиных  Ig)  конъюгированными антителами; промыть в ТБС. Гистохимические выявления фермента, которым помечены вторичные антитела; промыть в воде, доксарить ядра.

Второй вариант:

Инкубация спервичными поликлональными ( кроличьими) антителами против искомого антигена; промыть в ТБС ( три смены по 3 минуты). Инкубация со вторичными конъюгированными антителами; промыть в ТБС. Выявление продукта гистохимической реакции. Промыть водой, докрасить ядра.

Трехшаговый непрямой метод

  Первую и вторую инкубацию проводят как в двухшаговом методе, а затем проводят третью инкубацию с третичными конъюгированными антителами, которые « работают» против вторичных антител.

Инкубация с первичными моноклональными ( мышиными) антителами против искомого антигена. Промыть в ТБС ( три смены по 3 мин.). Инкубация со вторыми ( кроличьими Ig против Ig мыши), конъюгированными  с пероксидазой хрена, антителами; промыть в ТБС. Инкубация с третичными (свиные Ig против Ig кролика), конъюгированные с пероксидазой хрена, антителами; промыть в ТБС Гистохимическое выявление пероксидазой активности. Промыть в воде, докрасить ядра.

  Преимущество непрямых методов по сравнению с прямыми связано с интенсификацией окраски мест локализации антигена.

Методы с использование фирменных иммунных комплексов

  Эти методы иногда называют методом немеченых антител, предварительно формирующих фермент - антифермент иммунные комплексы. Этот тип иммунных комплексов состоит из фермента ( антиген) и антител против этого фермента. Стадии окраски включают первичные и вторичные немеченые антитела. А на третьем этапе используют растворимый иммунный комплекс фермент - антифермент. В ферментных иммунных комплексах содержится « излищек»  фермента и антитела против фермента, которые связываются  с ферментом через Fab. Первичные антитела и антитела иммунных комплексов должны быть получены от одного вида животных, в этом случае вторичные ( связующие) антитела, « подвязывают» антитела иммунных комплексов. Методы с использованием иммунных ферментных комплексов более чувствительны, чем прямой и непрямые методы, в которых фермент ковалентно связан с антителами, что не позволяет создать такую высокую концентрацию фермента, как в ферментных иммунных комплексах.

ПАП ( пероксидаза  антипероксидаза ) метод

  1) Инкубация с кроличьими ( мышиными)  первичными антителами;  промыть в ТБС ( три смены по три мин.).

  2) инкубация со вторичными антикроличьими антителами; промыть в ТБС

  3) Инкубация с иммунным комплексом ; пероксидаза хрена + кроличьи антипероксидазные антитела; промыть в ТБС