Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндомиокарда при миокардите (стр. 4 )

  4) гистохимическое выявление активности пероксидазы; промыть водой, докрасить ядра.

ЩФАЩФ ( щелочная фосфатаза антищелочная фочфатаза)

  (1) и (2) Инкубация, как в ПАП методе;

После каждого шага промыть в ТБС        

Инкубация с иммунным комплексом: щелочная фосфатаза+ антитела против щелочной фосфатазы ( от того же вида животного, что и первичные антитела) ; промыть в ТБС Гистохимическое выявление  активности щелочной фосфатазы; промыть в воде, докрасить ядра.

Авидин – биотиновые методы

  Биотин является низкомолекулярным витамином, который способен связываться  в высокой пропорции с высокомолекулярными  соединениями ( Ig, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза). Авидин - это гликопротеин, получаемый из яичного белка. Было замечено, что нарушения, наступающие в организме при потреблении больших количеств яичного белка, являются следствием биотиновой недостаточности, вызванной авидином, который имеет высокое сродство к биотину. С одной молекулой авидина могут связываться  четыре молекулы биотина. Авидин-биотиновые иммуногистохимические методы основаны на способности авидина или стрептавидина связываться с биотином, а биотина, в свою очередь, с иммуноглобулинами и ферментными маркероми. В качестве вторичных антител в этих методах используют биотинилированные антитела.

АБС ( авидин - биотин - пероксидазный комплекс) метод

(1) Инкубация с первичными кроличьими антителами; промыть в ТБС ( три смены по 3 мин.).

(2) Инкубация со вторичными биотинилированными антикроличьими антителами; промыть в ТБС.

(3) Инкубация с авидин-биотин - пероксидазным комплексом; промыть в ТБС

(4) выявление активности пероксидазы; промыть в воде, докрасить ядра.

Новые высокоэффективные методы (EPOS, ENVISION)

  Методы основаны на том, что к длинной молекуле полимера ( декстран) « пришиты» как антитела, так и ферменты. За счет увеличения концентрации фермента усиливается генерируемый в результате гистохимической реакции сигнал и, следовательно, повышается чувствительность метода.

Одношаговый – EPOS

  Принцип метода основан на том, что с полимером ( декстраном) связаны как первичные антитела, так и молекулы фермента.

Двухшаговый – EnVision

  В этом случае полимер конъюгирован со вторичными антителами и ферментом.

Метод CSA

  Другим высокоэффективным методом является набор CSA ( Catalyzed Signal Amplification). Принцип системы CSA заключается в увеличении числа молекул биотина, связывающихся с комплексом стрептавидин - пероксидаза.

Далее приводится пример иммуногистохимического окрашивания лаборатории НИИ кардиологии с использованием системы визуализации REVEAL Polyvalent HRP - DAB Detection System.

Промывка срезов в 3х буферах по 5 мин Срезы обводят гидрофобным карандашом, инкубируют с перкосидазным блоком в течение 10 мин для блокирования эндогенной пероксидазы. Для подавления фонового окрашивания срезы инкубируют 20мин с протеиновым блоком. Промывка в буфере 1-2 раза Наносим первичные антитела в соответствии с протоколом, 30 мин. Промывка в 3х буферах Наносим комплимент на срезы, на которых были нанесены мышиные антитела. Стекла со срезами на которых были нанесены кроличьи, АТ комплимент не наносим и оставляем в 3-ем буфере. Промывка в 2х буферах Нанесение HRP коньюгат( пероксидаза хрена) на все стекла - 15 мин. Промывка в 4х буферах Разводим ДАВ ( 1 капля субстрата на 1,5 мл буфера), 1,5 мин. Промывка в 4х буферах Докрашивание гематоксилином 1 мин. Промываем срезы в воде Дегидротирование в спиртах (4шт) и ксилолах (4шт), по 2 мин в каждой баночке. Заключение под бальзам и покровное стекло.

  Результат окрашивания: выявляемый антиген – коричневый, ядра сине-фиолетовые.

Глава II. Материалы и методы иммуногистохимического исследования биоптатов эндомиокарда.

  Базой исследования являлось патологоанатомическое отделение НИИ кардиологии Томского НИМЦ. Материалом исследования послужили биоптаты эндомиокарда пациентов с необъяснимыми аритмиями и сердечной недостаточностью.

  Эндомиокардиальная биопсия ( ЭМБ) является золотым стандартом для диагностики патологии сердца, в т. ч. криза отторжения при его трансплантации и методом выбора диагностики при миокардите. Исследование биоптатов позволяет оценить степень активности воспаления, выраженность фиброза миокарда, установить этиологию заболевания

  В большинство случаев осуществляется биопсия сердечной мышцы правого желудочка, левого - значительно реже. Выбор места биопсии миокарда зависит от цели исследования.

  Биопсию миокарда выполняют биоптомом. Биоптом – небольшой катетор с захватом на конце. Длина биоптома зависит от доступа, а диаметр – от диаметра катетера. Используют:

при доступе через внутреннюю яремную и подключичную вены - биоптомы 50 см при доступе через бедренную вену – биоптомы 95 и  105 см

  Используют биоптомы двух основных типов:

жесткие (  для установки не требуют проводникового катетера) гибкие ( устанавливаются через проводниковый катетер).

  Забирают 3 фрагмента эндомиокарда, полученные с помощью биоптома (BiPAL 7, Cordis Corporation, USA) трансвенозными доступом (через бедренную вену) из правого желудочка фиксируют в 10% забуференом формалине при комнатной температуре не более 24часов.

Проводка  материала.

  Успешная фиксация исследуемого объекта — лишь первое условие, необходимое для приготовления качественных микропрепаратов. Однако для того, чтобы добиться получения тонких срезов (в тысячные доли миллиметра), зафиксированный материал необходимо соответствующим образом подготовить: сделать достаточно плотным и в то же время нехрупким. Нужно придать ему такое состояние, чтобы при резке он не крошился и не деформировался, срезался тонкими ровными слоями, для этого ткань следует освободить от излишков фиксатора, обезвредить, пропитать и залить уплотняющей средой.

  Начиная с этого этапа и до самого конечного момента приготовления гистологического препарата, следует строго придерживаться правилам постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани.

  Для эндомиокардиальной биопсии используют ручную проводку, которая включает в себя 4 спирта в каждом по 30 мин, и 3 ксилола, по 20 мин. Для получения тонких срезов кусочки материала помещаю в банки с расплавленным парафином в термостат, где температура 60С, на 3 часа.

  Традиционный этап проводки имеет ряд существенных недостатков: трудоемкость, длительность (до четырех суток), испарение реагентов в воздух лаборатории (что небезопасно для сотрудников лаборатории, так как ксилолы образуют взрывоопасные паровоздушные смеси, вызывают острые и хронические поражения кроветворных органов, при контакте с кожей – дерматиты), а также нестабильное качество получаемой ткани, зависящее от человеческого фактора, а именно действий лаборанта. Для решения проблем такого рода лаборатории используют альтернативные реагенты, такие как изопропанол, являющийся нетоксичным, а также аппараты – гистопроцессоры, имеющие закрытый контур и таким образом не допускающие испарений в воздух лаборатории. Путем использования гистопроцессоров также можно значительно уменьшить время проводки по сравнению с ручным методом (до одного часа).

В настоящее время современные многие лаборатории оснащены специальным аппаратом гистопроцессором "SHANDON EXCELSIOR ES", с автоматическими этапами проводки материала.

2.3 Заливка в парафин

  Парафин при комнатной температуре — твердое гомогенное вещество. Существует несколько сортов парафина: мягкие (точка плавления 45-54С) и твердые (точка плавления 58-60С).

  В большинстве случаев для заливки применяют парафин с точкой плавления 54-56"С. Если резка предполагается при низкой температуре окружающей среды, то лучше применять парафин с более низкой точкой плавления (48—50°С). Нужная степень твердости парафина достигается смешиванием в различных комбинациях мягких и твердых сортов.

  Следует помнить, что обычный продажный парафин часто содержит газообразные примеси, которые при заливке образуют пузырьки, придающие парафину повышенную ломкость и значительно ухудшающие качество резки материала. Для избавления от этих примесей свежий парафин следует на длительное время оставить в расплавленном виде в плоских чашках (чтобы увеличить площадь для выделения газов) при температуре 70°С (для этого можно приспособить сушильный шкаф). Можно также подвергать парафин частому расплавлению и нагреванию (до появления дыма) с последующим быстрым охлаждением.

  Если парафин, несмотря на соответствующую подготовку, сохраняет жесткость, к нему следует добавить чистый пчелиный воск в количестве 2—5%, что придаст парафину большую эластичность.

Заливка в парафин требует тщательного соблюдения двух основных условий:

1) препарат должен быть полностью обезвожен,

2) не должен содержать спирт.

  Первое условие, как мы уже знаем, обеспечивается в процессе обезвоживания и уплотнения в батарее спиртов повышающейся концентрации.

  По окончанию проводки кусочки материала ложатся приготовленные деревянные брусочки и сверху заливаются. После того как блок застыл, приступают к приготовлению срезов с помощью микротома.

2.4 Техника приготовления и наклеивание срезов

Для приготовления срезов используются специальные приборы – микротомы.

  Методика приготовления срезов из парафинового блока для ИГХ практически не отличается  от обычного их изготовления для гистологической окраски. Однако есть ряд требований. Срез должен быть ровным, тонким 3-5 мкм, расправлять срез желательно в теплой дистиллированной воде (+25+28 С) или над спиртовкой, но не перегревать, выше +56С, так как высокая температура может разрушить антиген и результат реакции может быть отрицательным.

  Наклеенный на кассету парафиновый блок прочно закрепляют в зажиме микротома, расположив длинной осью параллельно длиннику микротома. Затем, установив необходимый угол резания и правильный угол наклона ножа, его прочно закрепляют винтовыми зажимами и располагают над блоком. После этого, регулируя винтами, механизм подачи, блок устанавливают таким образом, чтобы верхняя его плоскость находилась в горизонтальном положении и не доходила до лезвия ножа на 0,5—1 мм. Когда предварительная подгонка блока к ножу закончена, устанавливают микрометрическую шкалу на получение толстых (25—30 мкм) срезов и движением ножевых салазок начинают подавать блок вверх до получения с него первых полных срезов. Затем производят моделирование блока: срезают скальпелем избыточный парафин, оставляя вокруг залитого объекта слой не более 2—З мм, и придают блоку прямоугольную форму. После этого устанавливают микрометрическую шкалу на нужную толщину среза(от 0 до 6) и приступают к окончательной резке материала.