Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндомиокарда при миокардите (стр. 5 )

  Правильно залитые небольшие кусочки органов и тканей при оптимальном температурном режиме в помещении режутся хорошо, и срез, как правило, ложится на нож в расправленном состоянии (угол резания прямой). При резке больших блоков и твердого материала срезы часто закручиваются. Однако этого можно избежать путем придерживания и приподнимания среза кисточкой за передний его край в процессе резки. Готовый срез осторожно снимают с ножа влажной кисточкой, (в направлений от спинки к лезвию) и переносят либо на подготовленное предметное стекло, либо в ванночку с теплой (З5—40°С) дистиллированной водой. Воду предварительно кипятят, чтобы предупредить появление на нижней поверхности срезов пузырьков воздуха (который может быть растворен в воде), мешающих равномерному приклеиванию срезов к стеклу. Помещают срезы на воду (предметное стекло) обязательно поверхностью, прилежащей к ножу, определить которую можно по характерному блеску (верхняя сторона всегда матовая).

  При резке надо следить, чтобы волоски от кисточки не попадали под режущий край ножа, так как это приводит к повреждению лезвия.

  Серийные микротомные срезы с парафиновых блоков толщиной 3-4мкм перемещают на поверхность теплой воды (700С) для расправления, а затем на предметное стекло с полилизиновым покрытием.

2.5 Окрашивание и заключение срезов в бальзам

  Независимо от выбранного метода иммуногистохимического окрашивания перед окраской парафиновые срезы обязательно депарафинируются. Для этого их проводят по батарее из 3 ксилолов,3 спиртов, в каждом по 5 минут и промывают в дистиллированной воде. Затем в водяной бане проводиться высокотемпературная  демаскировка антигенов в демаскировочном буфере ( чаще всего используют цитратный или Tris-EDTA) в течение 20 мин при температуре 970С.

После остывания срезов и промывки срезов, срезы обводят гидрофобным карандашом, инкубируют с перкосидазным блоком в течение 10 мин для блокирования эндогенной пероксидазы, для подавления фонового окрашивания срезы инкубируют 20мин с протеиновым блоком.

  Срезы ин        кубируют при комнатной температуре 30минут с первичными антителами, Для иммуногистохимического окрашивания использовали антитела для иммунофенотипирования клеток инфильтрата - CD3 (маркер Т-лимфоцитов), CD45 (общий лейкоцитарный антиген), CD68 (маркер макрофагов); и антитела к вирусным антигенам -  вирусу герпеса 1,2,6 типов, LMP антигену вируса Эпштейн-Барр, цитомегаловирусу, аденовирусу, парвовирусу В19, энтеровирусному антигену VP-1. Далее срезы инкубировали 15 минут с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Затем наносят раствор хромогена DAB на 1 минуту. Между всеми этапами иммуногистохимического окрашивания, начиная с демаскировки антигенов, срезы промывают в PBS буфере (рН 7,2).

  Ядра докрашивают гематоксилином в течение 1 минуты. Срезы промываются в воде, регидратируют в  спиртах и ксилолах по 2 минуты, заключают под покровное стекло.

  Результат окрашивания: в клетках содержащих исследуемый маркер определяется коричневое гранулярное окрашивания цитоплазмы и /или ядра (в зависимости от типа маркера), ядра синие. Миокардит диагностировался при условии (СD45+)+(4CD68+)≥14 клеток в 1мм2. ( Приложение 1, рисунок 1,2)

Глава III.  Результаты исследований и обсуждение полученных результатов.

  Базой для написания дипломной работы послужила патологоанатомическое отделение НИИ кардиологии Томского НИМЦ с октября 2016 года по 1 июня 2017 года. За этот период были подготовлены к исследованию биоптаты миокарда от 62 пациентов. Из них 47 мужчин и 15 женщин в возрасте от 28 до 65 лет. Было установлено, что у мужчин частота выявления миокардитов по данным исследования эндомиокардиальных биоптатов, больше чем у женщин.

  Более частое выявление миокардита у мужчин по данным биопсии миокарда в НИИ кардиологии можно объяснить тем, что у мужчин чаще встречаются клинически более тяжелые, требующие лечения в стационаре, формы миокардита.

Оценка степени активности воспаления и выраженность фиброза при миокардите

  Оценка биопсийного материала производилась на серийных гистологических срезах. В соответствии с консенсусом Всемирной Федерации Сердца 1997г для установления диагноза миокардит количество клеток воспаления должно быть не менее 14 на площади 1 мм2, из них должно быть не менее 10 лейкоцитов CD 45+ и не более 4 макрофагов CD 68+.  Для оценки степени активности воспаления использовались следующие критерии: количество Т - лимфоцитов CD 3+ в 1мм2, некроз кардиомиоцитов и воспалительная инфильтрация эндокарда (таблица 1). Степень активности оценивают для выбора правильной терапевтической стратегии, решения вопроса о назначении иммуносупрессивных препаратов. Выраженность фиброза определяли по площади интерстициального фиброза, наличию субэндокардиального фиброза и фиброза эндокарда (таблица 1). Выраженность фиброза характеризует стадию хронизации воспаления и коррелирует с развитием тяжёлых аритмий и сердечной недостаточности.

Таблица 1.

  Оценка активности миокардита и степени выраженности фиброза

(Cristina Basso et all 2012г)

Параметры	0 [баллов]	1 [балл]	2 [балла]	3 [балла]
Grading [max балл - 5]	Некроз/дегенерация миоцитов	нет	очаговое	многоочаговое
Интерстициальное воспаление	<7 [CD3+/ммІ]	7 - 14  [CD3+/ммІ]	>14 [CD3+/ммІ]
Вовлечение эндокарда(воспаление и/или тромбоз)	нет	есть
Staging [max балл - 5]	Интерстициальный/заместительный фиброз	нет	10 -20 % [площади среза]	20 -40 % [площади среза]	>40% [площади среза]
Субэндокардиальный фиброз	нет	есть
Фиброэлестоз эндокарда	нет	есть

  Кроме иммунофенотипирования клеток инфильтрата, иммуногистохимическое исследование позволяет выявить наличие вирусных антигенов в миокарде. В НИИ кардиологии для этой цели используют антитела к вирусам герпеса 1, 2, 6 типов, вирусу Эпштейн-Барр, цитомегаловирусу, аденовирусу, парвовирусу В19, энтеровирусному антигену VP1. В зависимости от разновидности вируса, вызвавшего миокардит назначаются специфические противовирусные препараты, либо иммуномодулирующая терапия.

Заключение

  Опираясь на изученную литературу и проанализировав

данные иммуногистохимического исследования биоптатов миокарда проводимых в патологоанатомическом отделении НИИ кардиологии Томского НИМЦ, можно сделать следующие выводы:

  Иммуногистохимическое исследование эндомиокардиальной биопсии занимает основное  место в диагностике миокардита.  Исследование биоптатов позволяет оценить степень активности воспаления, выраженность фиброза миокарда, наличие вирусного генома в миокарде, установить этиологию заболевания.

  Иммуногистохимическое исследование с выявлением специфических маркеров, таких как общий лейкоцитарный антиген (CD45), маркер Т-лимфоцитов (CD3), общий маркер макрофагов (CD68), увеличивает чувствительность выявления миокардита до 50%, т. е. значительно больше, чем обычные гистологические методы.

  Окончательный, достоверный  диагноз миокардита может быть установлен только по результатам гистологического и иммуногистохимического исследования биоптатов миокарда. Морфологическое изучение биоптатов позволяет, прежде всего, дифференцировать миокардит тяжелого течения и ДКМП ( дилатационная кардиомиопатия) .

.

.

Список использованной литературы:

Руководство иммуногистохимические методы Edited by - George L. Kumar, Lars Rudbeck. Русское издание под редакцией и .  Москва, 2011 Практическая иммуногистоцитохимия ( методические рекомендации) , , . Санкт - Петербург 2002 год. Библиотека патологоанатома. Научно - практический журнал. , . Миокардиты. Стандарты морфологической диагностики при аутопсии и эндомиокардиальной биопсии. Санкт - Петербург  2010 год. , . Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань «Титул» 2004 год. B. Maisch, B. Bultman, S. Factor, et al., Конференции консенсуса Всемирной федерации сердца, определение воспалительной кардиомиопатии (миокардит): доклад двух экспертных комитетов по гистологии и вирусной кардиомиопатией, Heart beat 4 (1999) 3-4. C. Basso, F. Calabrese, A. Angelini, E. Carturan, G. Thiene, Классификация и гистологические, Иммуногистохимическая и молекулярная диагностика воспалительного заболевания миокарда, сердечной недостаточности Rev. 18 (2013) 673-681.

Приложение 1

Рисунок № 1. Диагноз миокардит. CD 45 ( общий лейкоцитарный антиген), Ядра докрашивали гематоксилином.

Рисунок №2. Диагноз миокардит. CD68 ( маркер макрофагов)