Транспорт полной последовательности кодирующей дистрофин в мышечные клетки при помощи высоко-вместительного гибридного вирусного вектора с сайт - специфичекими интегративными возможностями (стр. 2 )

Клетки. Условия роста для клеток человеческого цервикального рака (HeLa) были ранее описаны. (16). Культуры кардиомиоцитов новорожденной крысы  были любезно предоставлены А. ван дер Лаарсом. Процедуры по  обслуживанию этих культур описаны в другом месте.  (52). Все клетки сохранялись в увлажненном воздухе 10% CO2  и  37°C.

Первое поколениеAd векторов. Производство, очистка, и титрование векторов  Ad floxedШ  и Ad ДE1. EGFP с удаленным E1 были детализированы в другом месте (16, 17).

Испытание упаковки  hc векторной ДНК, кодирующей красный флуоресцентный белок. Четыре миллиона  PER. tTA. Cre76 клеток в  питательной среде (DMEM; Invitrogen)  с 10%-ой эмбриональной бычьей сывороткой (FBS; Invitrogen), и 10мМ MgCl2 были отобраны на шесть  пластин (Greiner). Впоследствии,  монослои были инфицированы вирусом в трех экземплярах  2.5 мкг  pAd/AAV. DsRed или  2.5 мкг pAd/AAV. DsRed и 0.5 мкг плазмиды экспрессии  AAV pKS. P5.Позитивные контрольные образцы состоявшие из PER. tTA. Cre76 клеток, инфицированы  2.5 мкг одной только обычной hcAd векторной плазмидой pAd. DsRed  или вместе с 0.5 мкг pKS. P5.Rep. Приорететные для трансфекции, pAd/AAV. DsRed и  pAd. DsRed.  были обработаны MssI (Fermentas), сопровождаемый инактивацией  фермента рестрикции в

течение 15 минут при 65°C. Перед добавлением к клеткам плазмиды были разбавлены в DMEM до  объема 100 мкл. Затем раствор ДНК был смешан с 100 мкл катионной липосомной суспензии, состоящей из 10 мкл Lipofectamine (Invitrogen) и 90 мкл  DMEM.

Липосомным ДНК комплексам позволили сформироваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Тем временем монослои были ополоснуты 1 мл DMEM. Впоследствии, липосомные ДНК комплексы были разбавлены в DMEM к заключительному объему 1 мл и добавлены к вымытым клеткам. После 3-ех часового инкубационного периода в 37°C, добавлен 1 мл DMEM, содержащего с 20%-ым FBS и 20 мМ  MgCl2,. После ночной инкубации питательная среда трансфекции была заменена новым DMEM, содержащим 10%-ый FBS, 10 мМ MgCl2, и Ad. floxedШ. После инкубации в течение 5 часов при 37°C, был удален прививочный материал, и добавлено 3.5 мл DMEM,  с 10%-ым FBS и 10 мМ MgCl2. После обнаружения полного цитопатического эффекта (CPE), приблизительно через 72 часа  после инфекции (p. i). Клетки были собраны и подверглись трем циклам замораживания (ванна жидкого азота) и размораживание (37°C водяная баня). Затем, продукты распада клеток были  центрифугированы  при 208 Ч г в течение 10 минут, и разъяснены фильтрацией через 0.45-мm-pore-size, MILLEX-ХА  (Millipore). Полезные действия переноса генов DsRed были определены проточными цитофотометриями следующим образом. Клетки HeLa были отобраны по 105 клеток на 24 - хорошо пластины (Greiner). После ночной инкубации сливные слои клеток получили 500 мкл пятикратных последовательно разбавленных  лизатов. Два дня спустя клетки были проанализированы на экспрессию DsRed при использовании счетной камеры потока FACSort (Becton Dickinson). Во всех случаях был проведен анализ при использовании программного обеспечения CellQuest (Бектон Дикинсон Иммунокитометри Системс). Действия переноса генов были вычислены из линейного диапазона кривых реакции дозы. Зараженные клетки HeLa использовались, чтобы определить второстепенные интенсивности сигнала.

Распространение, и определение количества двойных hcAd/AAV гибридных векторов, кодирующих белок  EGFP-дистрофин. Двойные hcAd/AAV. eDYS частицы были амплифицированы последовательным размножением на культуре PER. tTA. Cre76 клеток. Начальное  шаги по освобождению и сбору(определял P0) были выполнены с MssI-линеаризовавшим pAd/AAV. eDYS тем же самым методом что и при получении DsRed-кодирующих hc векторов. Затем, одна десятая основного hcAd/AAV. eDYS  была смешана с новой питательной средой и добавлена к 5.0 Ч 10^6 недавно отобранных PER. tTA. Cre76 клеток на шести  пластинах вместе с Ad. floxedШ в MOI 2 IU/клетках. После инкубации  5 - 6 часов прививочный материал был заменен на 3.5 мл DMEM,  с 10%-ым FBS и 10-мМ MgCl2. Клетки производителя были собраны после обнаружения CPE (обычно 3 - 4 дня p. i.) . Вышеупомянутая процедура была повторена во время последующих опытов с 7.0 Ч 106  PER. tTA. Cre76 клеток в 25-см2  колбах (Greiner) для пассажа P2, 2.2 Ч 107 PER. tTA. Cre76 клеток в 75-cм2  колбах (Greiner) для пассажа P3, и 8.7 Ч 107  PER. tTA. Cre76 клеток в 175-cм2 колбах (Greiner) для пассажа P4. Для каждого раунда распространения использовалась одна десятая  лизата из предыдущего пассажа.

Очищенные запасы гибридных векторных частиц были подготовлены из лизатов приблизительно 2.6 Ч 108  PER. tTA. Cre76 клеток в 12 75-см2  колбах в третьем пассаже (P3). Схема очистки состояла из ультрацентрифугирования, сопровождаемого тремя циклами ультрафильтрации, используя фильтры (Millipore). До ультрацентрифугирования лизаты клеток производителя были обработаны  дезоксирибонуклеазой I (Скала) в 25мкг/мл в течение 30 минут в 37°C. Векторные запасы были разделены на 50-мкл порции, которые были заморожены  в жидком азоте и сохранены при −80°C.

Концентрации функциональных двойных hcAd/AAV. eDYS частиц в очищенных гибридных векторных растворах  были определены титрованием  на клетках HeLa, используя цитометрию потока и на Ad. floxed?-инфицированных PER. tTA. Cre76 клетках при использовании проточной цитометрии  и прямой флюоресцентной микроскопии. В общей сложности 105 клеток HeLa были отобраны на 24  пластины. После ночной инкубации сливные слои клеток получили 500 мкл пятикратных последовательных разведений двойных hcAd/AAV. eDYS гибридных векторов. Два дня спустя клетки были проанализированы на экспрессию EGFP-дистрофина в счетной проточной камере  FACSort, как описано выше. В общей сложности 5 Ч 105 PER. tTA. Cre76 клеток были отобраны в двойном экземпляре на  24  пластинах. После ночной инкубации сливные слои клетки получили Ad. floxed? в MOI 2 IU/клетках, вместе с пятикратными последовательными разбавлениями гибридных векторов. После 4-ой инкубации при 37°C, пластины были подвергнуты центрифугированию в течение 20 минут при 1 500 Ч г, после которой была заменена  питательная среда. Клетки на одной пластине были взяты через 20 часов для  проточной цитометрии. PER. tTA. Cre76 клетки, зараженные AdfloxedШ использовались, чтобы определить второстепенные интенсивности сигнала. Слои клетки на другой пластине были покрыты агарозой на 3.0 мл, подготовленной, раствором  9.0 мл фенола в питательной среде (Invitrogen), 0.36 мл FBS, 0.18 мл MgCl2 на 1 М., 1.3 мл PBS, и 7.2 мл 2.5 % (wt/vol) агарозы SeaPlaque (FMC). Действия переноса генов на последней пластине были определены через 20 и 120 h p. i., считая  EGFP-дистрофин позитивные клетки, соответственно, при помощи инверсионного флюоресцентного  микроскопа Olympus IX51.

Извлечение ДНК. Очистка ДНК была выполнена как ранее описано. (15).

Извлечение ДНК двойного hcAd/AAV гибридного вектора. Кратные количества очищенного гибридного вектора обработанные  дезоксирибонуклеазой I при заключительной концентрации 0.3 мкг/мл в течение 30 минут в 37°C в присутствии 10-мМ MgCl2. Впоследствии, нуклеаза была инактивирована добавлением EDTA (pH фактор 8.0), сульфат додецила натрия, и протеиназы K (Скалы) в концентрациях 10 мМ, 0.5 %, и 0.1 мкг/мл, соответственно. Образцы  при 56°C в течение 1часа  извлечены дважды со смесью буферизованного  фенола, хлороформа, и изоамил алкоголя (25:24:1) и единажды с хлороформом. Гибридная векторная ДНК была восстановлена этаноловым осаждением.

Саузерн-блот-анализ. После электрофореза геля агарозы ДНК  подверглась капиллярному действиею мембраны из  нейлона (Hybond-XL; Эмершем Байосайенсес). Все исследования ДНК были маркированы [б-32P] dCTP (Эмершем Байосайенсес) при использовании системы маркировки ДНК HexaLabel (Fermentas).

Трансдукция кардиомиоцитов  новорожденной крысы и иммунофлюоресцентная микроскопия. Приблизительно 2 Ч 105 кардиомиоцитов новорожденной крысы, отобранных на  стеклах на ишесть  пластин, были преобразованы двойным hcAd/AAV. eDYS или Ad.?E1. Векторы EGFP в MOIs 103 формирующих центр единиц (FFU) / клетках  и 102 IU/клетках, соответственно. Ad. ДE1. EGFP - первое поколение Ad5-на-основе вектора, содержащего вместо E1 EGFP ORF под транскрипционным контролем человеческого раннего промотора цитомегаловируса и SV40 pA (17).

Отрицательные контрольные образцы  состояли из фективно преобразованных  клеток. Двойные hcAd/AAV. eDYS гибридные векторные частицы также использовались, чтобы преобразовать клетки HeLa в MOI 2 Ч 102 FFU/cell. После ночной инкубации  культуры кардиомиоцитов были вымыты дважды с PBS и пополнены новой питательной средой. Через 2 дня p. i. преобразованные и фективно преобразованные культуры были вымыты дважды с PBS  в течение 5 минут. Клетки были фиксированы с 4 % (vol/vol) параформальдегид в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Фиксатор был удален четырехкратным промыванием в течение 5 минут с 10-мМ глицином в PBSG. Затем, клетки были связанны 5 минут  1 % (vol/vol) Тритон X-100 в PBS при комнатной температуре. Детергент был удален тремя промываниями  5 минут с PBSG. Впоследствии,  блокирование было выполнено обработкой  клеток в течение 1 часа  с PBSG, содержащим 5%-ый FBS. Моноклональные антитела (MAb), направленный против определенного тропонина-I кардиотонического  маркера (cTNI; HyTest), был разбавлен 1:100 в PBSG с 5%-ым FBS. После ночной инкубации при 4°C, клетки были ополоснуты три раза  PBS и окрашены Cy3-антимышинными иммуноглобулинами осла (IgG) (H+L) антитело (Лаборатории Джексона Иммуноресирча) разбавленными 1:100 в PBSG, содержащем 5%-ый FBS. После инкубации  45 минут при 4°C, лишние вторичные антитела были удалены четыремя промываниями. Ядрами клетки были окрашены Hoechst 33342 (Молекулярные Исследования) при заключительной концентрации 10 мкг/мл в PBS. Клетки были выдержаны в течение 5 минут в темноте при  4°C и, впоследствии, Hoechst, 33342  был удален четырьмя промываниями с PBS. Исследования проводились  при использовании инверсионного флюоресцентного  микроскопа Olympus IX51. Цифровые изображения были сделаны при использовании ColorView Peltier - камеры  и использовано аналитическое программное обеспечение (Soft Imaging System).