Транспорт полной последовательности кодирующей дистрофин в мышечные клетки при помощи высоко-вместительного гибридного вирусного вектора с сайт - специфичекими интегративными возможностями (стр. 1 )

Транспорт полной последовательности кодирующей дистрофин в мышечные клетки при помощи высоко-вместительного гибридного вирусного вектора с сайт - специфичекими интегративными возможностями.

Manuel A. F. V. Gonзalves1,*, Gijsbert P. van Nierop1, Marloes R. Tijssen1, Pierre Lefesvre2, Shoshan Knaдn-Shanzer1, Ietje van der Velde1, Dirk W. van Bekkum2, Dinko Valerio1, and Antoine A. F. de Vries1

+ Author Affiliations

1Gene Therapy Section, Department of Molecular Cell Biology, Leiden University Medical Center 2Crucell N. V., Leiden, The Netherlands

       Миодистрофия Дюшена вызвана мутациями в гене дистрофина, что определяет цель для генной терапии. Однако, не многие векторы могут переносить 14-kb  кДНК в мышечную ткань in vivo или пролифирирующую мышечную ткань in vitro для дальнейшей трансплантации. Был представлен метод  использования  двойного высоко-вместительного аден-ассоциированного вектора (hcAd/AAV, который переносит две последовательности для синтеза полного дистрофина. Вектор генерирован при помощи вводной линейной молекулы ДНК  первично репликацированной и упакованной в  Ad капсид. После инфицирования клеток Ad вектором, репликации вирусной ДНК, клетки заражают ААV вирусом с конечным терминальным  повтором(ITR) , вирусная ДНК репливируется, ДНК упаковывается в вирусный капсид. Такие двойные гибридные вектора используются для экспрессии дистрофина в кардиомиоцитах in vitro и восстановления синтеза дистрофина в мышечных тканях mdx мышей in vivo. Введение в человеческие клетки данного генома может быть особенно полезно для лечения таких болезней как миодистрофия Дюшена

       Летальная Х-сцепленная рецессивная миодистрофия Дюшена - наиболее часто встречающееся мышечное заболевание, встречающееся с частотой 1:3500 новорожденных мальчиков. Миодистрофия Дюшена обусловлена мутацией гена белка дистрофина 427-kDa. В нормальных миофибриллах дистрофин крепит внутренний цитоскелет к мембране (4).Отсутствие такой связи в дистрофин-дефицитных волокнах способствует повреждению сарколеммы при механическом напряжении. Поврежденные мышечные клетки реплицируются при помощи спутниковых клеток. Истощение пула спутниковых клеток приводит к замещению мышечной ткани жировой и соединительной тканью. Что обуславливает значительное снижение мышечной функции примерно в возрасте 12 лет, а после 20 лет нарушение дыхательной и сердечной функции.

Хотя соматическая генотерапия может потенциально ликвидировать причину рецессивных моногенетических нарушений, поставляя функциональные копии дефектных генов в пораженные клетки, генетическое  лечение миодистрофии представляет собой  проблему из-за большого размера гена (14 КБ), а так же  большого объема  мышц. На данный момент происходит разработка стратегий  системной поставки в естественных условиях или улучшение векторов для переноса генов или пересадка клеток с миогенным потенциалом. Одновременно, разрабатывается рекомбинантный генетический код микродистрофина, стремящийся к  максимальной функциональности и минимальному размеру для переноса в  вирусным вектором, таких как аден-ассоциированнный вирус или ретровирусы. (45). Недавние исследования у трансгенных мышей предполагают, что микродистрофин мог бы быть эффективным в предупреждении повреждения мышц, хотя он не приводит к полному восстановлению мышц.(21).

Кроме того степень, до которой микродистрофин спасает страдающий дистрофией фенотип у более крупных животных и людей, неизвестна. Векторы AAV  тем не менее обещают быть эффективным средством переноса генов, потому что они могут преобразовать неделящиеся клетки, и достигнуть долгосрочной трансгенной экспрессии в иммунокомпетентных моделях животных человеческих болезней, таких как мышечные дистрофии (18, 21).Эти векторы основаны на дефектном не патогенном человеческом вирусе, который может встраивать свой геном в пораженные участки генома. (30, 43,29). Интеграция в 19 локус этой хромосомы зависит от взаимодействия  AAV Rep78 или Rep68 с специфическим  сайтом в повторяющейся последовательности AAV (ITRs) (7, 33),недавно идентифицированном элементе эффективной интеграции  (p5IEE) (38, 39) что совпадает с промотером  AAV  на карте в 5 позиции (p5) (33), и в локусе AAVS1  (54).

Эта особенность  AAV уникальна среди всех  известных  вирусов эукариот и его использование значительно улучшает  интеграцию и устойчивую экспрессию терапевтической ДНК. Однако, инкорпорация определенной  сайт-специфической  ДНК  в обычные векторы AAV  уменьшила бы их уже ограниченную способность кодирования, таким образом требуя использования еще меньшего микродистрофина для генотерапии миодистрофии Дюшена, который вряд ли будет эффективен. Альтернативный маршрут  генотерапии МДД - развитие улучшенного аденовируса высокой вместительности (hcAd), который не только разрешит поставку комплементарной ДНК во всю длину и таким образом синтез абсолютно функционального дистрофина, но также и включение генетических элементов для увеличения синтеза. С тех пор hcAd векторы сохраняют  только сигналы, вовлеченные в реплекацию ДНК и инкапсуляцию, остальные функции возлагаются на  упаковочно-дефектные Аd векторы, обеспечивающие  неструктурные и структурные белки. hcAd векторы сохраняют непревзойденную эффективность переноса генов в делящиеся и неделящиеся клетки, но испытывают недостаток в вирусных генах, которые делают их  более безопасными, и лучше приспособленными для длительной трансгенной экспрессии (28).Эти атрибуты продолжают изучаться.(36, 44, 51). Недавно был разработан двойной hcAd вектор путем упаковки в  Ad капсид молекулярно клонированный тандем двух  участков ДНК, содержащих промотер  CAG. В настоящее время эта конструкция обладает наибольшей экспрессией в скелетных мышцах mdx мышей (11, 12). Однако ДНК доставленная  Ad вектором не может длительно корегировать генетический дефект, как стволовые клетки (34, 25, 42, 46). Терапевтическое применение этих клеток как  источник пересаживаемых аутогенных миогенных клеток потребует их постоянной генетической модификации. Это может лучше всего быть достигнуто через трансгенную интеграцию в  хромосомную ДНК. Предпочтительно, интегрированная ДНК не должна содержать генетические элементы с активностью промотора направленной наружу, как существующим в ретровирусных длинных терминальных повторениях, чтобы избежать активации онкогенов. Идеально,  интеграция должна предназначаться для предопределенного места в  человеческом геноме, чтобы уменьшить риск инсерционного мутагенеза.

Мы описываем здесь новую hc вирусную векторную систему, которая усиливает эффективность  hcAd векторов, обеспечивая их способностью к сайт специфической интеграции чужеродной ДНК и удваивоению числа трансгенных копий, упакованных в каждой частице. Используя эти так называемые двойные hcAd/AAV гибридные векторы, эффективную поставку и экспрессию человеческой последовательности кодирующей дистрофин во всю длину, мы обрабатывали  крысиные  кардиомиоциты с  достижением эффекта. Далее мы обнаружили  синтеза белка дистрофина во всю длину в комбаловидных мышцах mdx  мышей в естественных условиях. Наконец, в доказательство провели эксперимент с человеческими  клетками, мы продемонстрировали, что двойные hcAd/AAV гибридные векторы могут использоваться, вместе с AAV Rep78 и  Rep68, для доставки чужеродной генетической информации в локус  AAVS1.

Материалы и методы

Рекомбинантная ДНК. Получение рекомбинантной ДНК было выполнено согласно инструкции с использованием специфических реагентов.(41). Все hc векторные шаблоны ДНК были вставлены в pBR322-производный вектор клонирования. Во-первых, плазмида pBR-HD-RE1.d5 была сделана. Эта конструкция  содержит нуклеотиды 1 - 454 из серотипа человека Эда 5 геномов (Ad5). Эта 454-bp область охватывает левый ITR плюс  и была амплифицирована (15). . Эти последовательности  сопровождаются серотипом AAV 2  (AAV2) от положений 153 - 300 нуклеотида, которые охватывают p5IEE и p5 промоторы. Эта 147-bp последовательность была получена посредством  ПЦР усиления  при использовании pBR. RepCap. TAA-не как шаблон и PR127 (5′-CCATCGATTGGAGTCGTGACGTGAATTACGTCATAGGGTTAGGGAGGTCCTGTATT AGAGGTCACG-3′) и PR128 (5′-CCACTAGTCCCGCTTCAAAATGGAGACC-3′) Плазмида  pBR. RepCap. TAA-Not содержит остаток 191 от 4492 дикого типа генома AAV2 , но имеет кодон ATG в позиции  321замененный при помощи остановки кодона TAA. Конец p5 последовательности ошибка региона Ad5 позиции нуклеатидов  от 35533 до 35938. Эта 405-bp 3′-терминальная некодирующая последовательность включает исправленный регион  Ad5 ITR  и была амплифицирована ПЦР с использованием  pWE/AflII-rITR. pac. Rfib5 (26), вместе с PR25 (5′-GCCACTGCAGCCTTACCAGTAAAAAAGAAAAC-3′) and PR26 (5′-ACCTGGGCCCATCATCAATAATATACCTTA). ПЦР амплификация Ad и AAV cis-acting  элементов выполнена  с использованием  платинового  Taq  DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen), и отсутствие мутаций в ПЦР амплифицированных последовательностях подтверждено ДНК секвенированием. В последующем  плазмида  pBR/NC-RE1.d5  получена  при использовании  pBR/HD-RE1.d5 с заменой  405-bp 3′-терминальной последовательности  Ad5 фрагментом ДНК содержащим  145-bp AAV2 ITR. Позже ДНК была получена из  pAAV/AdTRШ.5 (15). В последствие фрагменты содержащие  ген промотер человеческого  1б (EF1б) фактора из pEFO (подарок  L.-M. Houdebine [48]), полилинкер and the ген в-глобина кролика  pA из pCAGGS ( любезно предоставленный J.-i. Miyazaki [35]) был клонирован  p5IEE и 3′ Ad ITR в  pBR/HD-RE1.d5 и p5IEE и AAV ITR в pBR/NC-RE1.d5. Этот маневр проведен с конструкциями pBR/HD-RE1.EF и  pBR/NC-RE1.EF, соответственно. Следующим шагом стало очишение  EGFP-дистрофин ORF при помощи  pDysE (предоставленный  J. Tremblay [6]) и вставленный в полилинкер  обеих  pBR/HD-RE1.EF и  pBR/NC-RE1.EF,  pAd. eDYS и pAd/AAV. eDYS, соответственно. Челночная плазмида  pAd. DsRed и pAd/AAV. DsRed получены из pAd. eDYS и pAd/AAV. eDYS, соответственно, при помощи замены EGFP - кодирующей последовательности  ДНК  EGFP-дистрофин фрагментом содержащим красный флюоресцентный протеин  (DsRed) ORF и обезьяний вирус 40 (SV40) pA. Фрагменты получены из pDsRed. T4-N1 (предоставленный  B. Glick [3]). В итоге плазмиды  pAd. EGFP и pAd/AAV. EGFP получены из  pAd. eDYS и pAd/AAV. eDYS, соответственно, при помощи замены EGFP кодирующего участка  ДНК  EGFP-дистрофина  с фрагментом содержащим EGFP ORF и ген  человеческого  гормона роста  pA.  EGFP ORF принесенная плазмидой  pEGFP (Clontech), в то время как человеческий гормон роста  pA получен из конструкции  pEFO. Конструкция  pKS. P5.Rep содержала AAV2 rep под контролем эндогенных промотеров и следовательно  Rep78, Rep68, Rep52, и Rep40 белков. Плазмида pGAPDH. Rep78/68 направляла синтез только  Rep78 и Rep68, поскольку есть нововведение в геноме  AAV2 в позиции  993 триплет GGG в месте Rep52 и Rep40. Ген промотер  человеческой глицералделегид  3-фосфат дегидрогеназы был получен  из плазмиды  pGAP489CAT (предоставленной  S. Yanagisawa [1]). Полная нуклеотидная последовательность всех конструкций были доступны по требованию.