Транспорт полной последовательности кодирующей дистрофин в мышечные клетки при помощи высоко-вместительного гибридного вирусного вектора с сайт - специфичекими интегративными возможностями (стр. 3 )

Иммуногистохимия скелетных мышц. Двойные hcAd/AAV. eDYS гибридные векторные частицы (2 Ч 108 FFU) в 100 мкл PBS, содержащей 7%-ый глицерин), были введены  иглой в левую икроножную мышцу 6-недельных C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J мышей. В икроножные мышцы  C57BL/10ScSn и C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J мышей были введены  100 мкл PBS с 7%-ым глицерином, они использовались в качестве положительных и отрицательных контрольных групп для иммуногистохимии, соответственно. Экспериментирование с животными было выполнено в соответствии с протоколом исследования, одобренным комитетом по этике животных Лейденского университета. Целые икроножные мышцы были собраны  через 6 дней и заморожены в жидком азоте. Последовательные поперечные секции криостата с толщиной 10 мкм и охвата всей длины мышцы были получены каждые 30 мкм. Секциям позволили высохнуть быстро при 37°C. После регидратации секции были погружены в метанол, содержащий H2O2  0.035 % в течение 20 минут, и впоследствии ополоснуты с PBS. Секции были выведены в течение 45 минут в PBS, подкрепленной  4%-ым бычьим сывороточным альбумином (BSA), чтобы предотвратить неопределенное окрашивание. Человеческий дистрофин был обнаружен иммуногистохимией, используя  антитела MAb NCL-DYS2 (Novocastra) направленные против С окончания  белка. Этот MAb IgG1 изотип (подарок  Ginjaar), был разбавлен 1:40 в PBS, содержащей 1%-ый BSA, и маркирован 20-fold-diluted

пероксидазой  (HRPO) Затем, смесь антител была добавлена к образцам без дальнейшего разбавления, с инкубацией в течение 60 минут при комнатной температуре. После промывания секции были фиксированы  4%-ым формальдегидом в PBS в течение 30 минут и снова промыты PBS. Комплексы антител визуализировались инкубацией секций в 20-миллиметровом ацетате натрия (pH фактор 5.2) содержащий 5 % диметилформамид, 400 мкг 3-амино-9-этилкарбазол (Сигма) / мл, и H2O2 на 0.02 %. Промывание образцов  водой остановило ферментативную реакцию. Впоследствии, секции были контрастно окрашены гематоксилином-эозином и произведена светомикроскопическая оценка. Отрицательные контрольные группы состояли из секций ткани, которые перенесли всю красящую процедуру, но были выведены с HRPO-фрагментами, разбавленными 40-кратный в PBS, содержащей 1%-ый BSA вместо HRPO-маркированного NCL-DYS2.

Проба для определения  места  интеграции ДНК. В общей сложности 8 Ч 104  клеток HeLa были отобраны. После ночной инкубации клетки были инфицированы вирусом  0.5 мкг любого pKS. P5, pGAPDH. Rep78/68, или pEFO. DsRed. T4 при использовании 2.4 мкл ExGen500 (Fermentas) согласно инструкциям изготовителя. Клетки, инфицированные вирусом с последней конструкцией, служили и как отрицательный  контроль и как контроль для процедуры трансфекции ДНК. Инфицированные вирусом клетки HeLa были преобразованы с двойными hcAd/AAV. eDYS гибридными векторными частицами в трех различных MOIs (то есть, 18, 90, и 450 FFU/cell). После 2-х часовой инкубации клетки были вымыты PBS  и время лизиса составило  3 дня, затем они  были собраны, и геномная ДНК была извлечена как описано ранее (17). Образцы, содержащие 240 нанограммов хромосомной ДНК, были подвергнуты PCR с AAVS1-определенным инициатором pAAVS1b(24), вместе с  инициатором бетта R1 (5 ′-GCCAGATTTTTCCTCCTCTCC-3 ′) нацаленным на ген  в-глобина кролика  pA существующий в двойном hcAd/AAV химерном геноме. Каждый инициатор использовался при заключительной концентрации 0.2 мкM. Смеси ПЦР, содержащие 2 % (vol/vol) деионизированный формамид, 200 мкM трифосфатов дезоксинуклеозида, и 2.5 полимеразы ДНК SuperTaq U (Биотехнология HT), были помещены в ООН-термоблок (Биоматка), и программа ПЦР была начата  с инкубации в течении 3 минут при  94°C, сопровождалась 20 циклами 94°C в 60 сек, периода отжига 60 сек с температурой, уменьшающейся 0.5°C каждый цикл от 69 до 59°C, и дополнительный шаг  2 минуты при 72°C. Когда программа ПЦР достигла более низкой температуры отжига 59°C, 28 дополнительных циклов были выполнены при использовании вышеупомянутых условий  за исключением использования постоянной температуры отжига 59°C. Реакции были закончены инкубацией  10 минут при 72°C. Впоследствии, 3 мкл каждого образца ПЦР были подвергнуты ПЦР с AAVS1-определенным инициатором Cr2-AAVS1 (5 ′-ACAATGGCCAGGGCCAGGCAG-3 ′), вместе с олигодиоксирибонуклеотидом Бетой. R1. Те же самые условия циркуляции как описано выше были применены для ПЦР, после которого, две 3-мкл фракции каждой смеси реакции были подвергнуты электрофорезу  в геле агарозы. Затем, каждый набор фрагментов ДНК был передан посредством капиллярного действия мембранам Hybond-XL. Одна мембрана была выведена с 677-bp гибридным вектором определенного для ДНК исследования, тогда как другая мембрана была подвергнута воздействию 353-bp AAVS1.  (10) Обе пробы были очищены QIAEX. Параллельно, продукты ПЦР были очищены от геля и вставлены в pCR4-TOPO (Invitrogen) при использовании TOPO TA клонирующаяся системы (Invitrogen). Готовые  рекомбинантные плазмиды были переварены с EcoRI. Впоследствии, продукты переваривания, соответствующие pCR4-TOPO  плазмиды и  усиленные AAVS1-гибридные векторные соединения ДНК, были разделены в двойном экземпляре электрофорезом в геле агарозы. Впоследствии, саусен блот анализ  с 677-bp гибридным вектором с специфической  ДНК  или с 353-bp AAVS1 были выполнены. Наконец, последовательности нескольких нуклеотидов клонировались, фрагменты ПЦР были определены как ранее описано  (16) при использовании инициаторов T3 (5 ′-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3 ′) и T7 (5 ′-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ′).

Результаты

Накопление двойного hcAd/AAV гибридного вектора. Комплекс, заключенный в AAV  содержал ДНК AAV ITRs примыкающий или дикий тип последовательности AAV или рекомбинантная ДНК, также как двойные линейные молекулы, названные мономерными или димерными репликативными формами AAV. Димерные структуры возникают, когда AAV Rep78-или Rep68-зависимый разрыв в терминальном сайте(trs) AAV ITR терпят неудачу до переинициирования синтеза ДНК (23). Мы рассуждали, что могли эксплуатировать этот AAV ITR зависимый процесс димеризации и соединить его с репликацией ДНК,

чтобы собрать в клетках. Ad репликоны  со структурой от хвоста к хвосту, кодирующей две копии трансгена между элементами продвижения интеграции ДНК AAV p5IEE и ITR. Наша гипотеза была в том, что 5 ′ Ad, ITR обеспечит прохождение репликации  комплекса полимеразы ДНК, тогда как 3 ′ AAV ITR обуславливала образование ковалентно связанных двухспиральных димеры от хвоста к хвосту. Кроме того, при  разумном выборе размера  ДНК гибрида Ad/AAV, процесс димеризации пошел  бы  на поколение молекул, больше чем ∼28-КБ, а это  более низкий предел размера генома, требуемый для эффективной  упаковки ДНК  (37) , но меньший чем максимальный размер, который помещается в капсулы вируса (2). С этой целью плазмида  pAd/AAV. DsRed была построена (Рис. 1A). В этой плазмиде человеческий  ORF и единица экспрессии гена DsRed созданы  ITR и упаковывающий сигнал плюс вышеупомянутые элементы AAV (Рис. 1A). Плазмиды. DsRed, которые закодировали  регулярной hcAd векторной ДНК, содержит от генома  Ad исключительно оба окончания, включая происхождение репликации (расположенный в пределах ITRs) и упаковочные элементы (Рис. 1A). Эта конструкция использовалась в качестве шаблона  в экспериментах, описанных ниже. До трансфекции, pAd/AAV. DsRed и рDsRed были переварены  с MssI. Переваривание MssI освобождает большую часть плазмид с их поворотом, что повышает эффективность субстанции для инициации  Ad  ДНК зависимой репликации. (22). MssI - усиленные  pAd. DsRed и pAd/AAV. DsRed перенесены в E1- комплементарные PER. tTA. Cre76 клетки вмести или в отдельности от pKS. P5.Rep(16)  Белки  Rep78 и Rep68 связанные с AAV ITRs и содействующие инициации репликации обоих дикого и рекомбинантного геномомв. Мониторинг за DsRed-позитивными PER. tTA. Cre76 клетками при помощи флюоресцентной микроскопии выявил сравнимую эффективность трансфекции во всех образцах. Затем активность помощника Ad необходима для амплификации и упаковки ДНК шаблонов, проведенной при помощи инфекции Ad. floxedШ. Ad. floxedШ - Ad вектор с делецией Е1, чьи упаковочные сигналы  захвачены при помощи прямого повторения сайтов loxP  бактериофага Р1. PER. tTA. Cre76  клетках экспрессирующих  P1 Cre рекомбиназу, собрание  Ad. floxedШ частиц предотвращено в значительной степени при помощи  Cre/loxP-опосредованного отсечения  Ad упаковочных элементов (16). После появления CPE,  убирается продуцирующая клеточная культура и чистые лизаты  используются для инфицирования  индикаторных клеток HeLa.  После 2 дней установлен эффективный транспорт генов по наличию лизиса клеток при помощи  проточной флюоресцент-активной цитометрии. Лизаты, переданные клеткам инфицируют  pAd/AAV. DsRed и pKS. P5.Rep, показывают наивысшую активность генного транспорта. Образцы произошли из клеток, которые получили pAd. DsRed и pKS. P5. У pAd. DsRed и pKS. P5.Rep было 15.5 % ± 6.2 % активности переноса генов, обнаруженной в анализах  у  pAd/AAV. DsRed-и pKS. P5.Rep. инфицированных  клеток. Лизаты клеточных культур, инфицированных вирусом Аd DsRed или pAd/AAV. DsRed  показали полезные действия передачи репортерного гена 21.2 % ± 1.1 % и 25.5 % ± 13.2 %, соответственно, достигнутого с образцами, полученными из pAd/AAV. DsRed-и pKS. P5.Rep  инфицированных  клеток. Отрицательные  контрольные образцы, соответствующие инфицированным вирусом клеткам, которые не были заражены  Ad floxedШ, не приводили к экспрессии репортерного гена выше фона (не показанный). Из этих экспериментов мы приходим к заключению, что возможно включить в капсулы вируса  Ad/AAV химерные  геномы и что белки  Rep AAV, действительно увеличивают процесс освобождения/сборки.