Кальциевый транзиент в нервных окончаниях мыши при изменении температуры (стр. 2 )

Методом оценки количества выделяемого медиатора, является измерение квантового состава. Этот метод основан на анализе вызванных и спонтанных потенциалов концевой пластинки. В 1952 г. Фэтт и Катц [Fatt et al.,1952] обнаружили, что в синаптической области изолированной «покоящейся» мышцы спонтанно появляются очень малые потенциалы с амплитудой около 0,5 мв, которые возникают в случайные моменты времени со средней частотой около одного в секунду.

Отдельные разряды возникают в строго ограниченных «точечных» участках, разбросанных вдоль концевых синаптических разветвлений аксона. Амплитуда возникающего при этом изменения потенциала варьирует в зависимости от толщины мышечного волокна.  Кроме того, что эти разряды возникают спонтанно и беспорядочно Их называют миниатюрными потенциалами концевой пластинки, обусловленные локальным воздействием очень малых количеств ацетилхолина на небольшие участки постсинаптической мембраны. Это явление отмечено у позвоночных в нервно-мышечных соединениях всех типов; как выяснилось, сходные спонтанные потенциалы возникают и в межнейронных синапсах центральной нервной системы. В нормальных условиях все миниатюрные потенциалы много ниже порога возбуждения мышечного волокна и поэтому остаются локализованными и не вызывают сокращения.

Также имеются данные о том, что двигательные окончания даже в «покое» находятся в состоянии спорадической «секреторной активности» и выделяют небольшие количества ацетилхолина со случайными интервалами и средней частотой около одной порции в секунду. Нервный импульс на короткое мгновение очень сильно повышает эту активность, так что менее чем за 1 мсек происходит несколько сотен такого рода единичных событий. Некоторое количество вещества ацетилхолина непрерывно синтезируемого и накапливаемого в нервных окончаниях, «прорывается» в синаптическое межклеточное пространство и вызывает небольшие сдвиги постсинаптического потенциала.

Фетт и Катц обнаружили, что уменьшая синаптическую передачу с помощью понижения экстраклеточной концентрации кальция, а также увеличением концентрации магния постсинаптические ответы, которые вызываются стимуляцией нервов, имеют ступенчатую структуру. При этом некоторые из стимулов не взывают никаких ответов, некоторые вызывают ответы, амплитуда которых около 1мВ, идентичные по параметрам спонтанным МПКП. И наконец, все остальные вызванные ответы имеют кратную амплитуду относительно к амплитуде МПКП. Это явление было названо квантовой гипотезой. В физиологических условиях ПКП состоят примерно из 200 квантовых единиц, а вариации в их амплитуде невелики.
В условиях пониженной концентрации кальция размер одного кванта остается без изменений, однако квантовый состав очень невелик: 1,2 или 3 квантов.

Мы можем получить значение квантового состава двумя путями:
Первое из отношения средней амплитуды вызванных потенциалов и средней амплитуды миниатюрных потенциалов. [Castillo et al., 1954]

  , где m - квантовый состав 

Второе из метода выпадений (нулевых реакций) 

1.3 Роль ионов Са2+ в процессе выброса медиатора

В химических синапсах процесс выброса медиатора представляет собой разновидность регулируемого экзоцитоза [Neher, 1998].

Экзоцитоз - стыковка и слияние синаптической везикулы с пресинаптической мембраной и последующее высвобождение нейромедиатора в синаптическую щель.  Это означает, что в нервной терминали секреция накопленных и уже готовых к выбросу везикул или гранул осуществляется лишь под действием специального регулятора или триггера, роль которых выполняют ионы кальция [Авдонин c соавт., 1994].

Прирост концентрации кальция в аксоплазме терминали может происходить как за счет поступления его из наружной среды [Костюк, 1986], так и за счет высвобождения из внутриклеточных запасников - Са2+-депо (фрагментов гладкого эндоплазматического ретикулума, митохондрий, Са2+-связывающих белков и других структур) [Pozzan et al.,1994; Simpson et al., 1995].

В настоящее время подробно изучены свойства и роль потенциал-зависимых Са2+-каналов наружной мембраны в запуске Са2+-регулируемого экзоцитоза в химических синапсах [Tareilus at al., 1995]. Принято считать, что экзоцитоз обеспечивается дифференцированным вовлечением в активность определенных типов потенциал-зависимых Са2+-каналов, различающихся своим месторасположением на мембране терминали, потенциало-зависимостью, особенностями активации/инактивации и другими характеристиками [Neher, 1998].

Потенциал-управляемые каналы используются для запуска освобождения нейротрансмиттера в синаптическом соединении и вносят вклад в распространение ПД.

1.4. Регуляция уровня кальция в нервных клетках

Концентрация цитозольного кальция в эукариотических клетках регулируется трансмембранным транспортом и цитоплазматическим связыванием кальция. Движение ионов кальция через мембрану контролируется тремя основными процессами: 1) входом кальция в цитоплазму через Са2+-каналы плазмалеммы и через каналы, расположенные в мембране эндо(сарко)плазматического ретикулума; 2) выводом кальция из цитоплазмы благодаря активности кальциевых насосов плазмалеммы и кальциевых обменников; 3) аккумуляцией ионов кальция внутриклеточными кальциевыми депо и митохондриями. Последние служат системами кальциевого буфера, способными аккумулировать и накапливать ионы кальция, поддерживая таким образом гомеостаз кальция в цитоплазме.  Также одним из претендентов на роль кальциевых депо могут  выступать синаптические везикулы [Pezzati et al., 2001]. Однако, в настоящее время существуют данные, указывающие на то, что синаптические везикулы слабо участвуют в регуляции кальциевого метаболизма при частотной стимуляции [Macleod et al., 2004].

1.5. Кальциевые каналы

Кальциевые каналы обеспечивают поступление ионов Са2+ в цитоплазму клетки и выполняют очень важные и многочисленные функции, такие как: участие в электрогенезе, поддержание определённой внутриклеточной концентрации ионов Са2+, инициация секреции медиаторов и гормонов, формирование кратковременных и долговременных форм синаптической пластичности в ЦНС, регуляции экспрессии генов и т. д. [Костюк, 1986].

Различают Са2+-каналы плазматической мембраны и внутриклеточных органелл. Первые – обеспечивают поступление в цитоплазму внеклеточного кальция, вторые – кальция, запасённого во внутриклеточных структурах, к которым относят митохондрии и гладкий эндоплазматический ретикулум (в мышце – саркоплазматический ретикулум). На мембранах эндо - и саркоплазматического ретикулума описаны два основных типа лиганд-активируемых Са2+-каналов: инозитолтрифосфатные и рианодиновые [Балезина, 2002].

Функция Ca-каналов плазматической мембраны (ПМ) в процессе экзоцитоза не ограничивается проведением ионов кальция. Связь Ca-канала с синтаксином и SNAP-25 обеспечивает докирование синаптической везикулы в активной зоне и предотвращает процессы случайного экзоцитоза докированных везикул. Са2+-канал и секреторный аппарат работают как единый комплекс, и это функциональное взаимодействие определяет свойства и самого канала. В ответ на деполяризацию нервного окончания происходит открытие потенциал-зависимых Са2+-каналов, ионы кальция входят в терминаль, взаимодействуют с белками, инициируют экзоцитоз и освобождение медиатора [Николлс с соавт., 2003]. Для осуществления экзоцитоза необходимо создание высокой концентрации ионов кальция у везикулы в очень короткий промежуток времени. Короткоживущее "облако" ионов кальция около внутреннего устья канала в цитоплазме с концентрацией более 100 мкмоль/л получило название Са2+-микродомена. Везикулы могут подвергаться экзоцитозу только в том случае, если их Са2+-сенсоры находятся внутри микродомена, что достигается за счёт связи Са2+-каналов с докированными синаптическими везикулами. Вход ионов кальция через большое количество близкорасположенных каналов образует область повышенной концентрации ионов кальция в определённом участке нервного окончания и формирует кальциевый микродомен. Са2+-микродомен может включать и несколько соседних, близко расположенных активных зон.

По механизму активации кальциевые каналы могут быть разделены на несколько типов потенциал-управляемых и агонист-управляемых каналов. [Николлс с соавт., 2003]

Потенциал-управляемые каналы вносят существенный вклад как в регуляцию входа кальция в цитоплазму во время потенциала действия, так и в нейрональный электрогенез.

Второй важный путь потока ионов кальция через мембрану связан с активацией агонист-управляемых каналов, многие из которых обладают значительной кальциевой проницаемостью при физиологических условиях.

Третий, недавно обнаруженный, особый тип Са2+-каналов, контролируется наполненностью внутриклеточных кальциевых депо, осуществляя таким образом прямую связь между высвобождением Са2+ в цитоплазму из депо и входом в нее Са2+ через плазмалемму.

1. 6. Кальциевые насосы

Существует два семейства Ca2+-насосов, ответственных за устранение ионов Ca2+ из цитоплазмы: Ca2+-насосы плазмалеммы и Ca2+-насосы эндоплазматического ретикулума. Хотя они относятся к одному семейству белков (так называемому P-классу АТФ-аз), эти насосы обнаруживают некоторые различия в строении, функциональной активности и фармакологии.

Активность Ca2+-насоса плазмалеммы контролируется непосредственно [Ca2+]i: увеличение концентрации цитоплазматического кальция активирует Ca2+-насос [Tepikin et al., 1992]. В нейронах моллюска около 40% ионов кальция, входящих в клетку в ответ на деполяризацию мембраны, выводится из нейрона уже во время фазы нарастания [Ca2+]i, отражая таким образом активацию кальциевого насоса плазмалеммы увеличением концентрации цитозольного Ca2+

.

1.7. Кальциевые буферы и Ca2+-связывающие органеллы

В поддержании внутриклеточной концентрации ионов кальция принимают участие различные буферные системы, которые способны не только быстро утилизировать кальций, но и некоторое время поддерживать его высокую локальную внутриклеточную концентрацию за счёт освобождения в цитоплазму. Поэтому Са2+-микродомен существует большее время, чем длится входящий кальциевый ток, и обеспечивает более высокий уровень освобождения медиатора в этом месте.