Кальциевый транзиент в нервных окончаниях мыши при изменении температуры (стр. 3 )

Большая часть ионов Са2+, входящих в клетку, практически немедленно связывается цитоплазматическими местами связывания кальция [Костюк, 1986]. Цитозольные кальциевые буферы представлены главным образом Са2+-связывающими белками, такими как парвальбумин, кальмодулин, тропонин-С, кальретинин, кальциунеурин, белок S-100 [Heizmann et al., 1991]. Кроме того, цитозольная буферная емкость может быть опосредована АТФ, которая способна связывать значительное количество Са2+. 20-50% цитозольных кальциевых буферов могут быть удалены из цитоплазмы при перфузировании клетки, что показывает их мобильность, в то время как оставшаяся часть Са2+-связывающей емкости относится к фиксированным буферам. Мобильные кальциевые буферы могут играть важную функциональную роль, способствуя диффузии ионов Са2+ в цитоплазме и распространению Са2+ сигнала по клетке.

Кроме быстрого связывания цитозольного Ca2+ внутриклеточными Ca2+-связывающими белками, ионы кальция, попадающие в цитозоль, могут аккумулироваться аппаратом Гольджи или клеточным ядром, захватываться митохондриальными Ca2+-депо, имеющими достаточно невысокое сродство к Ca2+, или быстрыми депо, связанными с ЭПР или СПР, имеющими высокое сродство к Ca2+. Однако, если [Ca2+]i превышает 0,5 мкмоль/л, наблюдается существенное перераспределение [Ca2+]i в область митохондрий [Nicholls, 1985]. Буферные системы митохондрий принимают участие в удалении избыточного Ca2+ из цитоплазмы в клетках кишечника, некоторых типах нервных клеток и в секреторных клетках после повышения [Ca2+]i, стимулированного агонистами. Связывание кальция митохондриями обеспечивается активностью систем, расположенных на внутренней митохондриальной мембране. Ca2+ поступает в митохондрии по электрохимическому градиенту; разность потенциалов, обеспечивающая транспорт кальция, создается переносом электронов во время клеточного дыхания и связанного с ним переносом протонов. Перенос электронов по дыхательной цепи является основным механизмом, обеспечивающим энергетику транспорта кальция. Подавление дыхательной цепи карбонил-цианид-м-хлорофенил-гидразоном эффективно блокирует аккумуляцию кальция митохондриями.

1.8. Влияние температуры на процесс освобождения квантов медиатора

Изменение температуры среды существенно меняет скорость многих пресинаптических процессов, включенных в синаптическую передачу позвоночных. Roy White [White, 1976] изучая влияние температуры на трансмиссию в нейро-мышечном окончании лягушки, пришел к выводу, что нервно-мышечный синапс более чувствителен  как к охлаждению, так и нагреванию, чем двигательный нерв или сама мышца. Подобный результат был получен в нервно-мышечный синапсе диафрагмы крысы, который блокировался при 10оС, в то время как двигательный нерв и сама мышца все еще  продолжали работать при 5оС. Так же авторы других исследований отметили, что различные синаптические процессы также проявили чувствительность к температуре. Частота миниатюрных потенциалов концевой пластинки в нервно-мышечном синапсе лягушки возрастала при увеличении температуры [Li et al., 1958], а охлаждение мышцы кошки с 37 до 25 уменьшало амплитуду миниатюрных потенциалов концевой пластинки [Boyd et al., 1956].

Спонтанная секреция медиатора [Fatt et al., 1952; Boyd et al., 1956; Hubbard et al., 1971] длительность потенциала действия нервного окончания [Katz Miledi 1965], скорость спада облегчения [Hubbard et al., 1971] являются температурно-чувствительными процессами. Быстрое повышение температуры с помощью неодиевого лазера приводило к повышению скорости спонтанного освобождения, увеличению квантового состава ПКП и уменьшению синаптической задержки и ускорению спада постсинаптического ответа [Barrett E. et al., 1978]

Изучалось и влияние температуры на кальциевый ток. Так авторы статьи [Van Lunteren et al., 1992] установили зависимость кальциевого тока от температуры в симпатических нейронах жабы, включая процессы активацивации, деактивации и инактивации. Результаты данных исследований показали, что активация и деактивация кальциевого тока является наиболее чувствительными к температуре при средних значениях напряжения( от -20 до 0 mV)

Авторы статьи [Iftinca et al., 2006] показали, что способность кальциевых каналов Т типа проводить кальциевый ток меняется и зависит не только  от изоформы канала, но и от температуры. И результаты их исследований указали свойства кальциевых каналов и их функциональные роли могут меняться при приближении к физиологическим температурам.

Их исследования проводились при температурах 21 о С и 37 о С на разных изоформах кальциевых каналах теплокровных(крысы и человека).

Авторы изучающие изменение концентрации ионов кальция, вызванного стимуляцией, в различных типах митохондрий показали, что митохондриальный захват ионов кальция может быть особенно существенным в нервных терминалях, в которых наблюдаются большие входы ионов  кальция в небольшие объемы клетки. Эти ответы цитозольного кальция также возрастают при понижении температуры, предполагая, что поглощение митохондриального кальция в терминалях мыши должно быть температурно зависимым.

В работе авторов Lizette Vila [Vila et al., 2003]  изучалось изменение концентрации кальция в двигательной терминали мыши в области митохондриального матрикса. Авторы сообщали, что амплитуда кальциевого сигнала, характеризующего митохондриальный кальций во время частотной стимуляции, возрастает с выходом на плато, причем амплитуда этого сигнала возрастает с повышением температуры. Авторами из Японии изучалось влияние пониженной температуры на квантовое освобождение медиатора в нейромышечном синапсе мыши [Nishimura et al., 1993].

В результате этого исследования было получено, что уменьшение температуры до комнатной увеличивает вызванное высвобождение квантов медиатора, уменьшает спонтанное высвобождение.

Таким образом данные о влияние температуры на квантовый состав противоречивы, а данные о влиянии температуры на вход кальция в НО теплокровных при редкой стимуляции нерва до сих пор не были получены.

В связи с этим является актуальным исследовать влияние температуры на вход кальции в НО мыши и сопоставить эти данные с данными об изменении квантового состава при варьировании температуры окружающей среды.

1.9. Измерения Ca2+ при помощи флуоресцентных красителей

Флуоресцентные индикаторы позволяют изучать поведение кальция и применяются для исследования изменения внутриклеточной концентрации свободного кальция с помощью флуоресцентной микроскопии и спектроскопии.

Большинство современных флуоресцентных кальциевых индикаторов являются хелаторами кальция (EGTA, APTRA, BAPTA) и имеют модульную структуру, состоящую из метал-связывающего участка, связанного тем или иным образом с флуоресцентным красителем [Grynkiewicz et al., 1985]. Комбинируя различные метал-связывающие участки с различными красителями, получают разные индикаторы, подходящие для определённого эксперимента и оборудования.

Механизм действия флуоресцентного индикатора основан на связывании буфера с кальцием, что при освещении светом с длиной волны возбуждения вызывает изменение конформации красителя с испусканием кванта света. Очевидно, длина волны излучения отлична от длины волны возбуждения.

Рисунок 2 -  Структура хелаторов Ca2+ и индикаторов

Химические индикаторы, основанные на BAPTA (Рисунок 2) - рН-нечувствительном гомологе EGTA, связывают кальций намного быстрее, чем красители с EGTA (Рисунок 3), благодаря тому, что BAPTA является сильным кальциевым буфером и сохраняет свою высокую селективность к кальцию (kd=100 ммоль/л при pH 7.0) в присутствии конкурирующих миллимолярных концентраций магния и быстрого включения-выключения металлических связей (буферы BAPTA связывают и освобождают ионы Ca2+ в 50-400 раз быстрее, чем EGTA) [Николлс с соавт., 2003].

Рисунок 3 - BAPTA связывает кальций до того, как он достигает «кальциевого сенсора», который запускает высвобождение медиатора (А). Кальций достигает «кальциевого сенсора» быстрее, чем с ним свяжется EGTA (Б)

Связывающие участки основанных на BAPTA хелаторов могут способствовать изменению аффинности, обеспечивающей чувствительность и определяющей сродство к кальцию в широком диапазоне концентраций (от наномолей до миллимолей).

Свойства флуоресцентных индикаторов формируют ряд факторов, которые следует учитывать при определении направления применения красителей (Indicators for Ca2+, www. ).

Форма индикатора (соль, эфир, декстран-сопряжённая форма), в зависимости от выбранного метода загрузки красителя, влияет на внутриклеточное распределение и удержание индикатора. Соль и декстран-форму загружают, как правило, микроинъекциями. Напротив, проникающие в клетку acetoxymethyl (AM) эфиры можно пассивно загружать в клетку, где они расщепляются внутриклеточной эстеразой.

Режим измерения диктуется качественными или количественными данными о концентрации иона. Ионные красители, демонстрирующие спектральные сдвиги при связывании ионов, могут быть использованы для ратиометрических измерений, которые позволяют получать абсолютные значения концентрации ионов кальция и практически не зависят от неравномерности загрузки красителя, толщины клетки, эффектов фотообесцвечивания и утечки красителя.

Выбор длины волны возбуждения и излучения определяется в основном типом используемого оборудования, а также автофлуоресценцией образца и наличием других флуоресцентных или фотоактивируемых элементов в эксперименте.

Константа диссоциации Kd должна быть согласована с интересующим диапазоном концентраций Ca2+. Индикаторы должны регистрировать изменения концентрации приблизительно от 0.1 Kd до 10 Kd. Константа диссоциации для кальциевых индикаторов значительно зависит от многих факторов, включая pH, температуру, ионную силу, вязкость, связывание белков и присутствие Mg2+ и других ионов (в особенности поливалентных). Флуоресценция свободного индикатора очень слаба и увеличивается в 100 раз при связывании с Ca2+.

Внутриклеточная калибровка индикатора Ca2+ может быть достигнута либо посредством изменения уровня Ca2+ внутри клетки с использованием ионофора или же помещением красителя в среду с известной концентрацией Ca2+ и последующей её регистрацией. Для создания нулевого уровня внутриклеточного свободного кальция в точке калибровки флуоресцентных индикаторов используется в том числе и BAPTA.