Кальциевый транзиент в нервных окончаниях мыши при изменении температуры (стр. 1 )

Министерство образования и науки РФ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ

КАФЕДРА ФИЗИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Направление: 020400.62 – Биология

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

КАЛЬЦИЕВЫЙ ТРАНЗИЕНТ В НЕРВНЫХ ОКОНЧАНИЯХ МЫШИ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ

Работа завершена:

"___"_________ 2016 г.                ____________________        ()

Работа допущена к защите:

Научный руководитель

к. б.н., с. н.с. КИББ РАН

"___"_________ 2016 г.                ____________________        ()

Заведующий кафедрой

д. б.н., проф.

"___"_________ 2016 г.                ____________________        ()

Казань–2016

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ	4
ВВЕДЕНИЕ	5
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ	8
1.1 Синапс	8
1.2 Медиатор	9
1.3 Роль ионов Са2+ в процессе выброса медиатора	11
1.4 Регуляция уровня кальция в нервных клетках	12
1.5 Кальциевые каналы	13
1.6 Кальциевые насосы	14
1.7 Кальциевые буферы и Ca2+-связывающие органеллы	15
1.8 Влияние температуры на процесс освобождения квантов медиатора	16
1.9 Измерения Ca2+ при помощи флуоресцентных красителей	19
1.10 Ca2+-флуоресцентные красители, возбуждаемые видимым светом	22
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ	25
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ	25
2.1 Объект исследования	25
2.2 Электрофизиологические исследования	26
2.3 Оптические исследования	26
2.4 Статистическая обработка результатов	28
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ	29
3.1 Влияние температуры на квантовый состав вызванных потенциалов концевой пластинки	29
3.2 Разработка методики доставки флуоресцентного красителя в двигательные нервные окончания теплокровных	31
3.3 Влияние температуры на величину кальциевого транзиента в терминальных ответвлениях мыши	34
3.4 Обсуждение	35
ВЫВОДЫ	39
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ	40

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПД – потенциал действия

АЦ  – ацетилхолин

АЦЭ – ацетилхолинэстераза

НО – нервное окончание

МПКП – миниатюрный потенциал концевой пластинки

ПКП – потенциал концевой пластинки

ЦНС – центральная нервная система

ПНС – периферическая нервная система

ПМ – плазматическая мембрана

ЭПР – эндоплазматический ретикулум

СПР – саркоплазматический ретикулум

LAL – мышца разгибатель уха levator auris longus

ВВЕДЕНИЕ

Изучение процессов передачи информации в живых объектах является одним из приоритетных направлений биологии. Обмен сигналами между клетками осуществляется через синапсы – специализированные контакты [Николлс с соавт., 2003]. Кальций давно известен как важное звено в процессе синаптической передачи [Katz et al., 1965]. Деполяризация пресинаптического нервного окончания во время потенциала действия открывает потенциал-зависимые кальциевые каналы, через которые кальций входит в клетку и включает процесс выброса медиатора из везикул. В нервно-мышечных синапсах позвоночных (синаптических контактах между нервом и мышечной клеткой) ионы кальция играют ключевую роль в регуляции секреции квантов ацетилхолина в ответ на стимуляцию нерва. При уменьшении концентрации кальция в наружном растворе уменьшается высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечном соединении, вплоть до полного блокирования постсинаптических ответов. Изучение кальциевого метаболизма в синаптическом контакте является ключевой задачей синаптологии, поскольку вход кальция в пресинаптическое окончание во время потенциала действия запускает все основные механизмы синаптической передачи.

Температура является одним из важных определяющих факторов физиологических процессов. Известно, что работа нервно-мышечного аппарата зависит от температуры окружающей среды. От температуры зависит скорость распространения потенциала действия и работа внутриклеточных молекулярных механизмов. Кинетика секреции квантов медиатора имеет ярко выраженную температурную зависимость. Данные о влияние температуры на квантовый состав противоречивы, а данные о влиянии температуры на вход кальция в НО теплокровных при редкой стимуляции нерва до сих пор не были получены.

В связи с этим является актуальным исследовать влияние температуры на вход кальции в НО мыши и сопоставить эти данные с данными об изменении квантового состава при варьировании температуры окружающей среды.

Измерение кальциевого тока в нервно-мышечном соединении является нетривиальной задачей, при решении которой встает ряд методических трудностей. Малые размеры пресинаптического окончания не позволяют измерять кальциевый ток обычными электрофизиологическими методами [Bullen et al., 1999]. Для анализа метаболизма кальция в нервном окончании применяют оптические методы регистрации, основанные на использовании специальных кальций-чувствительных флуоресцентных красителей, интенсивность свечения которых изменяется при взаимодействии со свободными ионами кальция (кальциевый транзиент). Таким образом, можно оценивать изменение концентрации ионов, входящих в нервное окончание во время потенциала действия [Sabatini et al., 1998].

Данная работа основана на применении флуоресцентного метода анализа кальциевых сигналов, в основу которого положено использование индикаторов, специфичных к кальцию, и специальной экспериментальной установки, оснащенной высокоскоростной камерой. Метод позволяет детализировать пространственную динамику, оценивать поведение ионов кальция в рамках группы или отдельных клеток.

Работа выполнялась в OL Нейрофармакологии и в лаборатории биофизики синаптических процессов Казанского института биохимии и бифизики КазНЦ РАН.

Целью данной работы является исследование влияния температуры на кальциевый транзиент и вызванные потенциалы концевой пластинки  в нервном окончании мыши.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Разработка методики доставки кальциевого красителя в периферические нервные окончания теплокровных животных.

2. Регистрация и анализ Ca2+-транзиента и квантового состава вызванных потенциалов концевой пластинки при различных температурах. Сравнение результатов, полученных флуоресцентным и электрофизиологческими методами.

Научной новизной данного исследования является разработка метода доставки кальциевых индикаторов в нервные окончания теплокровных животных. До настоящего исследования такая методика на периферических синапсах теплокровных не осуществлялась. Впервые был зарегистрирован кальциевый транзиент в ответ на редкую стимуляцию двигательного нерва в терминали мыши с применением высокоскоростной камеры. Был получен экспериментальный материал о влиянии температуры на квантовый состав и пресинатпический уровень кальция в периферических нервных окончаниях теплокровных. 

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.. Синапс

Нервные клетки сообщаются друг с другом и другими клетками посредством синапсов – специализированных образований, обеспечивающих передачу информации посредством проведения нервного импульса [Николлс с соавт., 2003]. В строении синапса выделяют три основных структуры: пресинаптическую мембрану на терминали аксона одной клетки, постсинаптическую плазмалемму иннервируемой клетки и синаптическую щель между ними. Синапсы осуществляют передачу импульса между различными типами клеток. Различают межнейронные, нейроэффекторные (иннервируемая клетка мышечная или железистая) и нейрорецепторные (контакт между нейроном и вторично-чувствующей рецепторной клеткой) синапсы. Нейроэффекторные синапсы в зависимости от органа-эффектора бывают нейромышечные, нейрососудистые, нейросекреторные.

По действию на иннервируемую клетку синапсы делят на возбуждающие и тормозные. По механизму передачи существуют химические (Рисунок 1), электрические и смешанные. Наиболее распространёнными у высших животных и человека являются химические синапсы

Рисунок 1 -  Последовательность основных процессов в химическом синапсе

1.2. Медиатор

В химических синапсах задействован сложный механизм передачи потенциала действия через синаптическую щель с межклеточной жидкостью (20-50 нм), опосредованный через медиаторы (трансмиттеры). В зависимости от применяемого посредника различают адрен-,  холин-, дофамин-, гистамин-, пурин-, ГАМК-, опиатэргические и другие синапсы [Николлс с соавт., 2003]. Сами медиаторы могут иметь различную природу. Единственным представителем класса сложных эфиров среди медиаторов является ацетилхолин, самый распространенный посредник в организме человека. Кроме сложных эфиров, медиаторы относят к биогенным аминам (дофамин, норадреналин, изо-пропилнорадреналин, серотонин, гистамин), аминокислотам (ГАМК, глутаминовая, аспарагиновая кислоты, глицин, аргинин), пептидам (энкефалины, эндорфины, ВИП, вещество Р, ангиотензин, соматостатин), пуринам (АТФ) и веществам с малой молекулярной массой (N0, СО). Медиаторы так же, как и синапсы, подразделяют на возбуждающие (АХ, глутаминовая кислота, аргинин) и тормозные (ГАМК, глицин, вещество Р, серотонин, АТФ, дофамин). Есть медиаторы, которые в зависимости от рецепторов постсинаптической мембраны могут оказывать как возбуждающий, так и тормозной эффект (норадреналин, изопропил-норадреналин, гистамин).