Основным критерием исследования была клиническая оценка обвисания кожи по фотографической шкале. Дополнительным критерием - клиническая оценка гладкости кожи, глубины морщин, цвета и блеска кожи, и самооценка пациентом. Биопсии брались исследуемой и контрольной области лица у 19 пациентов, 9 на гистологическое исследование и 10 - на определение сократительной активности фибробластов in vitro.
Основные результаты
Оценки обвисания кожи производилась в Т0 и Т1, непосвящённым в исследование дерматологом, по 6-балльной шкале Эзуре11 в трех областях лица - верхней области щеки и носогубной складке (В), нижней области щеки (С) и в боковой области щеки (D), как показано на рисунке 1.
Дополнительные результаты
Непосвященный в исследование дерматолог оценил возрастные изменения кожи исследуемой и контрольной стороны лица.
Здоровье кожи. Клиническая оценка блеска кожи проводилась посредством визуальной шкалы CLBT™, включающей 7 параметров. Так, 4 оттенка кожи (красно-розовый, бледно-розовый, оливковый и бежевый) от 10 до 10% лежат в основе финального результата трех параметров (прозрачность кожи, яркость, и степень светоотражения) по шкале от 0 до 1012. Гладкость кожи оценивалась по параметрам, измеренным по аналоговой 9-балльной шкале.Суммировались показатели: неровность поверхности кожи, глубокие и мимические морщины/дефекты кожи, текстура кожи, наличие темных кругов под глазами, наличие папул или микроцист. Наименьшая сумма показывает наибольшую гладкость кожи и лучший внешний вид.
Самооценка
Добровольцы заполняли опросники в Т0 (до процедур) и Т1 (после 24 сеансов), оценивая по 9-бальной шкале следующие параметры:
- Мимические и глубокие морщины Неровность кожи Носогубные складки Эластичность Жесткость/мягкость Сияние Темные круги под глазами
Также добровольцы сравнивали эластичность, мягкость кожи, морщины и обвисание кожи до и после процедур. Им был предложено ответить на вопросы по удовлетворенности полученными результатами.
Фотографирование
Каждый визит проводилась фотосъемка в фронтальном и боковых ракурсах всего лица и нижней его части, при естественном освещении, с закрытыми глазами. Использовался фотоаппарат Canon EOS Rebel XS с двумя вспышками расположенными на Faraghan Medical System (90° и 45°). Фотографии были выравнены по освещенности с использованием Gretag MacBeth Colour Checker Chart, и по позиционированию с использованием стереотаксической таблицы Eotech SA)
Исследования in vitro
Были произведены панч-биопсии участков кожи с исследуемой и контрольной сторон лица, у 9 добровольцев (4 мужчин и 5 женщин). Использовались панчеры диаметром 2 мм. Биоптаты были помещены в стерильную марлю, моченную солевым раствором и незамедлительно перенесены в чашки Петри. При Т=37°C в течение 30 минут, происходило прилипание образца к пластиковой поверхности чаши. Затем было добавлено 3 мл питательной среды Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) с добавлением 10% телячьей сыворотки, 40 мг/мл гентамицина и 2 мг/мл фунгизона. Инкубация при 37°C в среде с 5% CO2. Фибробласты была выделены после 3-4 недель инкубации путем обработки трипсин-ЭДТА. Питательная среда менялась два раза в неделю.
Миграционная способность
Фибробласты, подвергнутые механо-стимуляции и интактные, переносились в трехмерный гидратированный коллаген с помощью модифицированной техники Белла и соавт.13 для изучения их функциональной способности, измерением сжимания свободной поверхности.
Коллагеновые пластинки были получены смешиванием 6 частей 1,76 концентрата питательной среды, 3 частей раствора коллагена 1 типа (из крысиных хвостов) и 1 части суспензии фибробластов (8?105 cells/mL). Смесь была помещена в чашки Петри диаметром 6 см. полимеризация в гель происходила в течении 30 минут при 37°C. После чего была добавлена питательная смесь, которая менялась каждые 48 часов. Измерение диаметра пластинки производилось но на 10 день, для чего была использована метрическая шкала на прозрачном фоне. Измерение миграционной активности фибробластов позволяет увидеть возможную реорганизацию внеклеточного матрикса после механо-стимуляции.
Измерение сократительной активности фибробластов с использованием GlaSbox®
Прибор состоит из восьми квадратных ячеек, в которых размещены пластинки, по краям которых крепятся силиконовые ребра с датчиками натяжения. Расстояние между ребрами - 27 мм. Сигнал от датчиков натяжения усиливается, преобразуется и анализируется специальной компьютерной программой в режиме реального времени. Фибробласты и пластинки приготавливались аналогичным описанному выше способом. Полимеризация культуры в приборе происходила в течение 30 минут при 37°C. Было добавлено 2 мл питательной среды. GlaSbox® помещался в увлажнённый термостат при 37°C. Измерение сократительной активности производилось в течении 24 часов после инкубации. Измерение результата проводилось в условных единицах.
Эксперимент позволяет выяснить, влияют ли на фибробласты проведенные сеансы механо-стимуляции (17 минутные процедуры дважды в неделю на протяжении 8 недель).
Общие исследования
Фибробласты после механо-стимуляции и контрольные были культивированы в 12-луночном планшете в концентрации 0.04?106 клеток и инкубированы при 37°C. НА следующий день было добавлено по 500 мкл DMEM, еще через 48 часов, супернатант (верхняя часть) была перенесена в 10% ингибирующий протеазы раствор (Merck Millipore, Франция). До проведения исследования образцы хранились при 80°C.
Исследование коллагена 1 типа, гиалуроновой кислоты, ММП-1, МПП-9 и тканевого ингибитора ММП1 (ТИМП-1)
Количественная оценка производилась методом ферментного иммуносорбентного анализа (USCN, Life Science and RayBiotech®) Образцы были помещены в лунки с иммобилизованными на биотине специфическими антителами. После промывки образцов, коньюгированные с пероксидазой хрена авидин (для коллагена 1 типа и гиалуроновой кислоты) или стрептавидин (для МПП-1, МП-9 и ТКМП-1) были добавлены в лунки и инкубированы. После добавления раствора тетраметилбензидина, в лунках содержащих исследуемое вещество происходило изменение цвета раствора. Биохимическая реакция останавливалась добавлением раствора серной кислоты, а интенсивность цвета измерялась спектрофотометром при длине волны 450 нм. Концентрация определялась по оптической плотности образцов на стандартной кривой.
Исследование эластина
Общий растворимы й эластин измерялся колориметрическим способом (Fastin™ Elastin Assay; Biocolor). Образцы были осаждены раствором трихлоруксусной кислоты и аргинином, после чего был добавлен связывающий эластин 5,10,15,20-тетрафенил-21,23-дипорфин тетра-сульфонат. Образованный комплекс был диссоциирован раствором гуанидин-гидрохлорида и пропан-1-олом.
Колориметрия производилась при длине волны 550 нм на спектрофотометре Multiscan EX (Thermo).
Морфологическое исследование
Под местным обезболиванием 1% р-ром ксилокаина были произведены панч-биопсии кожи яремной области у 5 мужчин и 5 женщин в Т1 (после 24 сеансов). Биопсии были взяты с обоих сторон лица, промаркированы, и в дальнейшем сравнивались попарно, слепым образом.
Каждый биоптат был разделен на фрагменты, одни были фиксированы 3% параформальдегидом и фосфатном буфера, а другие - 2% р-ром глютаральдегида в щелочном какодиловом буфере и инкубировались при 4°C в течение 3 дней. Для морфологического исследования, фрагменты фиксированные глутаральдегидом, были отмыты и залиты 1% р-ром тетрохлорида осмия на 2 часа. После дегидрирования последовательными спиртовыми разведениями, фрагменты были импрегнированы и залиты эпоксидной смолой на трое суток при 60°C. Ультратонкие срезы были окрашены ацетатом уранила и цитратом свинца.
Фрагменты, фиксированные параформальдегидом, после отмывки, дегидратации и переноса на LR White resin, полимеризованной ультрафиолетом А при 4°C (EMS, USA). Ультратонкие срезы были никелевой решетке с формварным покрытием (EMS, USA) были связаны с антителами к ?-актину (разведение 1/50), отмыты фосфатным буфером, и инкубированы в течение часа на анти-мышиных антителах козы, меченых коллоидным золотом (разведение 1/10, Amersham, UK). После финальной отмывки фосфатным буфером и дистиллированной водой, срезы были окрашены ацетатом уранила.
Цифровое изображение срезов было получено просвечивающим электронным микроскопом. Полуколичественным методом оценены плотность и другие характеристики кожного матрикса - пучков коллагена и эластичных волокон. Также оценивались морфологические признаки метаболической и секреторной активности фибробластов и экспрессия ?-актина.
Статистический анализ
Данные предоставлены как средние с указанием стандартного отклонения. Для проверки нормальности распределения данных использовался тест Шапиро-Уилка.
Различия между группами данных, полученных в начале и после завершения процедур, были оценены двухвыборочным t-критерием Стьюдента ( в случае ненормального распределения данных - тестом Вилкоксона). Для дисперсионного анализа применялся критерий Стьюдента-Ньюмана-Кейлса при нормальном распределении данных, или критерием Фридмана с критерием Данна при ненормальном распределении.
Анализ вариации одного признака, дополненный точным тестом Фишера (при необходимости) производилась для in vitro анализов. Анализ по двум признакам (группа и день), дополненный точным тестом Фишера (при необходимости) проводился для оценки миграционной активности и сократительной способности.
Результаты
Всем тридцати добровольцам (20 женщин и 10 мужчин, средний возраст 44,5±4.6 лет) проведены 24 сеанса механо-стимуляции. 13 женщин получали противозачаточные препараты.
В анамнезе у добровольцев отменены депрессия (n=4), сезонная аллергия (n=2), грыжа пищеводного отверстия диафрагмы (n=1), экзема рук (n=1), семейная гиперхолестеринемия (n=1), эпилепсия (n=1), аллергия на никель (n=1), аллергия на трамадол (n=1), эмфизема (n=1) и хронический бронхит (n=1).
Основные результаты
Клиническое уменьшение обвисания кожи, по меньше мере, по одному параметру шкалы Эзуре наблюдалось в 73% (n=22) случаев на исследуемой стороне лица, и в 53% случаев (n=16) - на контрольной (P=0.108). Этот же показатель для зон С и D - 70% (n=15) на стороне проведенных процедур, и 50% (n=15) - на контрольной (P=0.114).
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 |
