Учебно-методический комплекс дисциплины «Основы биотехнологии» (стр. 14 )

11.  Какие материалы используются в биотехнологии в качестве фильтроваль-ных порошков?

12.  Осветляющие фильтры — в чем их отличие?

13.  Микрофильтрация: что обеспечивает возможность высоких скоростей фильтрации при достаточно концентрированных суспензиях?

14.  Каковы недостатки микрофильтрации биомассы микроорганизмов по сравнению с тканевой фильтрацией?

15.  На чем основана флотация микроорганизмов?

16.  Что дает использование различных методов флотации — пневматической, напорной, электрофлотации?

17. В чем смысл использования специальной флотирующей жидкости при ?а-порной флотации?

Лекция № 10 ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ

Основные понятия. Классификация методов дезинтеграции. Механические методы. Немеханические методы.

В случаях, когда целевой продукт локализован в клетках мик­роорганизмов и самопроизвольно не переходит в жидкость, при­ходится применять специальную операцию разрушения клеток, в результате чего их содержимое оказывается в водной фазе, откуда его можно выделять практически теми же методами, что и другие, внеклеточные, продукты метаболизма.

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ

Дезинтеграция клеток — это не стерилизация. При дезинтегра­ции важно не просто сделать клетки нежизнеспособными (напри­мер, путем нагрева), но главное нарушить оболочку клеток, чтобы внутриклеточное содержимое (цитоплазма) могло выделиться в окружающую клетку жидкость или могло быть выделено из нее через ослабленную клеточную стенку.

Нежелательны дальнейшие измельчения полученного дезинтеграта.  Именно «однократность» процесса разрушения клетки отличает дезинтеграцию от измельчения обычных материалов.

И все же в терминах процессов и аппаратов химической тех­нологии процесс дезинтеграции более всего близок к процессу измельчения материалов. Трудности по сравнению с традицион­ными объектами химической технологии заключаются в следую­щем:

микробные клетки весьма малы;

они имеют плотность, близкую к плотности окружающего ра­створа;

клеточные стенки построены из природных биополимеров, до­статочно эластичных и прочных.

Различия в составе клеточных стенок. Клеточные стенки различ­ных видов микроорганизмов отличаются по толщине, составу и свойствам. Рассмотрим эти различия.

Грамположителъные бактерии. Стенки достаточно толстые (15—20 нм), содержат 40—90% пептидо-гликанов ( т. е. полимеров с аминокислотными и глюкозными составляющими цепи), а ос­тальное — полисахариды и тейхоевые кислоты.

Грамотрицателъные бактерии. Клетки содержат гораздо более тонкий пептидо-гликановый слой (до 2 нм), но зато имеют внеш­нюю мембрану.

Дрожжи имеют стенки клетки толщиной около 70 нм (чем клетка старше, тем толще). Они построены в основном из полиса­харидов (глюканов и маннанов).

Грибы. В большинстве грибов стенки клетки состоят главным образом из полисахаридов — глюкана, хитина, а также гликопротеина.

Животные клетки имеют очень тонкие стенки (одна цитоплазматическая мембрана).

Чувствительность клеток к внешним механическим воздействиям. По чувствительности к внешним механическим воздействиям клетки разной природы располагаются в таком ряду (в порядке понижения чувствительности):

животные клетки -» грамотрицательные бациллы и кокки -> грамположительные бациллы —> дрожжи -» грамположительные кокки -> споры —> мицелий грибов.

Классификация методов дезинтеграции клеток. В общей форме классификация представлена на рис. 14.1.

Все методы состоят из двух больших групп: механические (фи­зические) и немеханические методы.

Механические методы делятся на две подгруппы в зависимости от фазы, в которой происходит процесс дезинтегра­ции: твердофазные и жидкофазные. Твердофазные методы по­добны методам измельчения твердых тел любого происхождения (размол, экструзия). Понятно, что биомасса клеток перед нача­лом такого процесса должна быть переведена в замороженное со­стояние.

Немеханические методы включают в себя сушку, которая резко изменяет структуру клеток и их оболочек, и ли­зис различной природы (под воздействием физических, хими­ческих и ферментативных факторов).

МЕХАНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Механические жидкофазные методы. В этих методах биомассу используют в виде суспензии, хотя это уже не просто культураль-ная жидкость, а достаточно хорошо сгущенная суспензия (с кон­центрацией биомассы 4—30 %).

Рассматривая проблемы масштабного перехода, мы упоминали о механическом воздействии на клетки. Указывались даже преде­лы окружной скорости мешалки, которые не нужно превышать, чтобы клетки не повреждались (8 м/с). Может быть, достаточно просто превысить эту скорость, да еще специально сделать мешал­ки с острыми краями, чтобы достичь нужного эффекта? Что-то в этом роде используется для измельчения и гомогенизации расти­тельных и животных тканей — гомогенизаторы. Однако эффек­тивность таких устройств по отношению к клеткам не столь ради­кальна. Для бактерий размером 0,5—1 мкм никакие острые края мешалок не будут достаточно остры, разве что для нежных клеток животного происхождения.

Наиболее распространены в этом классе баллистические дезинтеграторы, напоминающие по своей конструкции ша­ровые мельницы. Эти дезинтеграторы имеют камеру с вращаю­щимся ротором (или просто вращающуюся камеру).

Камера заполняется специальными мелющими телами — стек­лянными или полимерными шариками — и обрабатываемой сус­пензией микроорганизмов. Размеры шариков порядка 0,3—0,5 мм (установлено, что эти размеры являются оптимальными). Далее обеспечивается вращение ротора и воздействие мелющих тел на клетки путем истирания, раздавливания.

Чем выше скорость вращения барабана (а скорости здесь дости­гают 2000 об/мин и более), тем больше эффективность дезинтег­рации.

Эффективность оценивается по величине R — отношению кон­центрации разрушенных клеток к исходной концентрации клеток, загруженных в дезинтегратор.

Концентрация микроорганизмов в суспензии не влияет на каче­ство дезинтеграции в довольно широких пределах (40—200 г/л).

Недостатки баллистических дезинтеграторов:

сложность устройства;

большая энергоемкость;

низкая производительность;

разогревание суспензии, которое приводит к порче тех компо­нентов клетки, ради которых и проводится их дезинтеграция.

Для преодоления последнего из перечисленных недостатков ис­пользуют охлаждение, вплоть до охлаждения сжиженным СО2, но и это не очень помогает.

Воздействие на клетки перепада давления. В таких дезинтеграто­рах клетки могут находиться либо во взвешенном состоянии в жидкости (тогда она пропускается через сопло), либо в заморожен­ном состоянии (тогда их продавливают через узкую щель методом экструзии).

В первом случае действуют два эффекта: кавитационный с обра­зованием срезающих турбулентных пульсаций и декомпрессионный, в результате которого при резком сбросе давления клетка как бы взрывается изнутри.

Во втором случае влияют именно механические воздействия кристаллов льда на стенки клетки.

В жидкостном варианте давление создается плунжерным насо­сом или прессом. Величина давления варьируется от 10 до 210 МПа, чаще - 50-55 МПа.

Недостатки этого способа: необходимость высоких давлений; низкая производительность (отверстие мало!); плохая работа на мицелиальных микроорганизмах (они забива­ют отверстие даже при столь высоких перепадах давления).

Те же недостатки характерны и для экструзии. Здесь давления достигают 550 МПа __  Ультразвуковая дезинтеграция. Применяются частоты озвучивания суспензии 15-25 кГц.  Здесь также происходит нагрев суспензии  I

Для больших масштабов метод мало применим, так как отсут­ствуют мощные генераторы ультразвука, к тому же в толстых сло­ях жидкости происходит гашение звука.

В табл. 14.1 представлена сравнительная чувствительность от­дельных видов клеток к разрушению различными механическими методами.

Показатель эффективности дезинтеграции R колеблется в ши­роких пределах — от 10—20 % до 90—95 % и даже до 100 % с раз­личными, конечно, затратами.

Энергетические затраты составляют для баллистических дезин­теграторов 0,3—1 Дж/мг биомассы и для нагнетательных дезинтег­раторов 0,5—1 Дж/мг биомассы (это очень большие затраты).

НЕМЕХАНИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Сушка — наиболее простой метод, который резко изменяет структуру клеточной оболочки. После сушки, в результате кото­рой клетки не остаются живыми и теряют внутриклеточную влагу, в оболочке клетки появляется много «трещин». Ресуспендирование высушенных клеток в водной фазе позволяет выделить внут­риклеточные компоненты. Недостатком метода является то, что при горячей сушке денатурируются ферменты и инактивируются многие биологически активные вещества.

Лизис, т. е. разрушение, «разъединение» клеточной оболочки, кажется наиболее привлекательным для решения задач выделения внутриклеточных продуктов. Методы лизиса можно подразделить на физические, химические и ферментативные в зависимости от характера воздействий, вызывающих лизис клеточной оболочки.

Физические методы лизиса включают в себя метод осмотического шока и метод попеременного замораживания — оттаивания.

Осмотический шок. По этому методу в суспензии сначала созда­ется высокое осмотическое давление (например, с помощью 1 М глицеринового или 1 М сахарозного раствора). Затем производится резкое разбавление суспензии водой. При этом клетки разрушают­ся под действием высокого внутриклеточного осмотического давле­ния. Подобным же образом действуют растворы солей.

Есть, например, такие микроорганизмы — галофилы, которые культивируются на высококонцентрированных солевых средах. По окончании процесса культивирования разбавление культу-ральной жидкости водой почти сразу приводит к лизису клеток. Это используется в технологии — не требуется специальных ухищрений по дезинтеграции клеток.

Замораживание—оттаивание. Известно, что замораживание используется в противоположных целях -— для длительного хране­ния микроорганизмов в жизнеспособном состоянии. Но при этом и замораживание, и оттаивание проводят в специальном програм­мированном режиме, препятствующем повреждению клеток. При дезинтеграции, наоборот, используют режимы, способствующие повреждениям клеточных оболочек.