Учебно-методический комплекс дисциплины «Основы биотехнологии» (стр. 18 )

Эту задачу выполняет процесс хроматографии. Хроматография известна больше в измерительной технике, где с ее помощью решают задачу количественного определения вещества, находящегося в сложной смеси близкихпо составу веществ (например, углеводороды нефти или углеводы в сложных природных смесях сахаров). Между тем в технологии на тех же принципах основан процесс, который бо-лее точно называют препаративная хроматография. По существу, это специфический способ десорбции сорбированной любым способом смеси веществ, чаще всего на микропористых сорбентах.

Как уже было сказано, при обычной схеме десорбция не очень-то различает разные вещества близкого состава и молекулярной массы, которые при десорбции выделяются вместе. Хроматография позволяет это сделать.

При хроматографии поток элюента, выходящий из слоя сорбента, не собирается весь в одну емкость, а фракционируется по времени пропускания элюента через колонку.

Дело в том, что десорбция разных ло молекулярной массе или, точнее, разных по сродству к сорбенту веществ протекает с разной скоростью. Поэтому сначала в поток перейдут вещества с меньшей молекулярной массой и менее связа?ные с сорбентом, а затем все более и более трудно десорбируемые. Если измерять концентрацию вещества в потоке элюента во времени, то можно наблюдать ряд пиков различной высоты, разделенных участками низкой концентрации (рис. 16.5).

В измерительных приборах (хроматографах) высота и площадь пиков являются основой для определения концентрации вещества. В препаративной хроматографии поток элюента, собираемый за различные промежутки времени является основой для разделения смеси веществ на более однородные по составу растворы.

Так можно разделять разные белки, разные аминокислоты или разные сахара. За основу разделения берется время выхода, отсюда и название метода («хромато» — время).

Рассмотренный пример можно назвать адсорбционной хроматографией, он основан на поверхностном связывании растворенного компонента. Аналоогично этому существует ионообменная хроматография, где сначала связываются, а затем с разной скоростью десорбируются ионы растворенных компонентов.

Интересной разновидностью хроматографии в биотехнологии является так называемая «аффинная хроматография». В ней для сорбции и десорбции используют биоспецифичное вещество, которое подходит к соответствующей вьщеляемой молекуле, как ключ к замку. Это могут быть ферменты или иммуносорбенты. Сначала практически полностью происходит связывание специфичного вещества, а потом путем изменения элюента оно выделяется с довольно четким фронтом.

Так можно разделять и ферменты, если в качестве сорбента использовать закрепленный на носителе «лиганд» — вещество, подобное субстрату, на который фермент действует. Разное сродство ферментов к субстрату может являться основой для их разделения по скорости образования и распада фермент-субстратного комплекса:

Преимущества хроматографии: высокая селективность;

возможность разделения веществ с близкими свойствами; мягкие условия проведения процесса.

Недостатки:

более низкая скорость десорбции, необходимая для улавлива-ния разных «пиков» выделения веществ;

обычно более разбавленные растворы;

более сложное аппаратурное оформление процесса

5. БИОСОРБЦИЯ

Биосорбцией обычно называют такие процессы, в которых в качестве сорбента используются сами микроорганизмы, клетки или их компоненты.

Наиболее известно применение биосорбентов для извлечения металлов из растворов.

Микроорганизмы обладают биохимическими механизмами сорбции металлов, позволяющими достигать концентраций металлов, в тысячи и даже в миллионы раз ббльших по сравнению с их концентрацией в жидкости, из которой металл извлекается.

Некоторые из таких сорбируемых металлов входят в состав ферментов и нужны клеткам. Поэтому сорбция железа, магния, цинка, меди, молибдена — нормальная физиологическая функция клеток.

Но эти же пути связывания клетки используют и для совсем чужеродных металлов, таких, как серебро, ртуть, уран, которые клетке для нормального развития не нужны. Но клетка сорбирует эти металлы как бы «по привычке».

Механизмы связывания металлов. Металлы могут связываться как растущими, так и нерастущими и даже мертвыми или разрушенными клетками. Сначала металл связывается поверхностью клетки, а затем медленно проникает внутрь. Бактерии связывают металлы лучше, чем дрожжи. Известно, например, накопление урана или свинца клетками бактерий рода Місгососсис. Кадмий, никель, кобальт, рубидий сорбируются клетками родов Васіllus и Ез?егіс?іа соіі. Клетки бактерий рода Рseudomonas использовали даже для извлечения урана из морской воды, где он содержится в очень низких концентрациях. Описано также выделение золота, серебра, других драгоценных металлов платиновой группы с помощью биосорбции.

Общая схема биосорбции металлов. В раствор с металлами добавляется суспензия микроорганизмов. Происходит поверхностное связывание металлов, образование комплекса металл—микроорганизмы.

Биомасса с сорбированным металлом отделяется от суспензии одним из методов разделения.

Выделение металла осуществляется:

либо десорбцией в мягких условиях, после чего освобожденная от металла биомасса вновь отделяется от раствора и может быть многократно использована в процессах биосорбции;

либо деструктурированием биомассы путем добавления к ней крепкой кислоты, щелочи или даже в пирометаллургическом процессе. Такое жесткое обращение с биомассой возможно в случаях, когда ее получение дешево или сама она является отходом какого-либо производства.

В некоторых технологиях в качестве биосорбента используют дезинтегрированные клетки микроорганизмов, часто высушенные. Они имеют более высокую удельную поверхность взаимодействия сорбента с жидкостью.

6. ИММУНОСОРБЦИЯ

Рассмотренные методы биосорбции, относящиеся к металлам, не слишком специфичны. При выделении многих белков, наоборот, часто используют очень специфичные высокоселективные методы. Они основаны на связывании антител с определенным участком молекулы изучаемого белка. Такой метод позволяет «распознавать» в смеси белков только один из них, к которому вы-работано иммунной системой антитело.

Вьщеленные из крови иммунизированных животных антитела (а среди них могут быть и очень специфичные моноклональные антитела, которые могут определить среди белков, например, белки родственников) иммобилизуются на каком-либо носителе и ста-новятся таким образом иммуносорбентами, используемыми для высокоселективного выделения веществ.

На основе иммуносорбентов разрабатывают диагностикумы, которые позволяют не только распознавать различные инфекци-онные заболевания, в том числе и вирусные (например, СПИД), но также и наследственные заболевания, опухоли и многое другое.

Вопросы для повторения

1.  Назовите основные разновидности сорбционных методов выделения про-дуктов микробиологического синтеза.

2.  Что такое изотерма Ленгмюра?

3. Что является движущей силой процесса ионного обмена?

4.  По каким принципам выбирают размер гранул ионообменной смолы?

5.  Чем отличаются ионообменные колонны в виде открытого и закрытого фильтров?

6.  Назовите термины, используемые для участвуюших в процессе ионного об-мена вешеств на стадиях сорбции и десорбции.

7.  Можно ли использовать ионообменное выделение продукта непосредствен-но из суспензии микроорганизмов? Укажите преимущества и недостатки такого процесса.

8. Чем отличаются жидкне ионообменники от жидкофазных экстрагентов?

9.  Чем отличается адсорбция микропористыми сорбентами от ионного обме-на?

10.  Какая основная характеристика используется для оценки качества микро-пористых сорбентов?

11. Чем хроматография отличается от десорбции?

12.  Какие существуют разновидности хроматографии?

13.  Перечислите преимущества и недостатки хроматографии при выделении продуктов микробиологического синтеза.

14.  Назовите основные механизмы биосорбции металлов.

15.  Расскажите о разновидностях биосорбции металлов: с деструкцией и с ре-генерацией клеток микроорганизмов.

16.  Расскажите об иммуносорбции: принцип действия, преимущества и недо-статки.

Лекция № 13  Мембранные методы в биотехнологии

1. Микрофильтрация

2. Диализ

3. Ультрафильтрация

4. Обратный осмос.

Мембранные методы используют в биотехнологии для выделения, очистки и концентрирования продуктов. Все они внешне похожи на фильтрацию (поскольку схема процесса включает в себя полупроницаемую перегородку), но предназначены для разделе-ния частиц разного размера и несколько отличаются по движущей силе процесса и аппаратурному оформлению,

Мы уже упоминали микрофилътрацию, основной задачей кото-рой является отделение микроорганизмов и взвешенных частиц.

В процессах выделения и очистки продукта чаще используют мембранные методы другого типа: диализ, ультрафилътрация и обратный осмос, которые позволяют «фильтровать» уже не только твердую фазу, но и просто растворенные в жидкости молекулы, причем не обязательно очень большие по размеру.

Улътрафилътрация проводится обычно при размерах частиц или молекул 10 нм — 10 мкм, обратный осмос и диализ — при размерах 0,5 нм — 0,5 мкм.

1. МИКРОФИЛЬТРАЦИЯ

Микрофильтрация является наиболее близкой к обычной фильтрации системой, которую мы уже упоминали в разделе, связанном с отделением биомассы от культуральной жидкости. Размер пор микрофильтрационных мембран варьируется от 0,1 до З. мкм. Это позволяет задерживать бактерии, дрожжи, грибы и вы-сокомолекулярные вещества, такие, как жиры.

Наиболее известно использование микрофильтрации как средства деконтаминации питательных сред, дозируемых подпиток, жидких пеногасителей и титрующих агентов для поддержа-ния величины рН. Это позволяет избежать теплового воздействия на стерилизуемые растворы. В связи с этим важно, чтобы сами микрофильтры могли стерилизоваться паром перед нача-лом операции и регенерироваться после длительной эксплуата-ции. Такими свойствами в наилучшей степени обладают метал-локерамические трубчатые мембранные элементы, которые могут регенерироваться обратным током пара. Для ускорения процесса микрофильтрации часто повышают температуру, чтобы снизить вязкость жидкости.

Микрофильтрация часто используется для стерилизации сред. В этом случае поры должны быть не более 0,2 мкм, чтобы исключить проскок микроорганизмов очень маленьких размеров.