Учебно-методический комплекс дисциплины «Основы биотехнологии» (стр. 15 )

Недостатками метода являются большая длительность и энергоем­кость и к тому же невысокая степень дезинтеграции. Это не позволяет широко использовать данный метод в промышленном масштабе.

Химические способы лизиса предусматривают воздействия на клетку химических реагентов различной природы, которые приводят к деструкции упорядоченных структур клеточ­ной стенки микроорганизмов.

Обработка суспензии микроорганизмов такими реагентами, как щелочь, кислота, мочевина, аммиак, бутанол, толуол, пероксид водорода, детергенты, повышает проницаемость клеточных сте­нок, благодаря чему биополимеры выводятся из клеток в раствор. Для усиления действия возможно использование упомянутых реа­гентов в комплексе с повышением температуры, резким измене­нием величины рН.

Некоторые антибиотики, ингибирующие рост клеток микроор­ганизмов, оказывают литическое воздействие на клетки. Среди реагентов упоминают также глицерин, олеиновую кислоту, способ­ствующие быстрому лизису клеток.

Эти способы имеют важный недостаток. Химические реагенты могут вступать в реакцию с извлекаемыми из клетки биополиме­рами и к тому же остаются в лизированной суспензии, откуда их потом трудно выделять.

Ферментативные способы лизиса. Использова­ние биологических агентов для ферментативного лизиса клеточ­ных оболочек является одним из наиболее перспективных методов. Среди этих методов различают: автолиз — разрушение кле­точных стенок собственными клеточными ферментами, ферментолиз — добавление протеаз, гликаназ и других ферментов в ра­створ, добавление пенициллина как вещества, препятствующего синтезу материала клеточной стенки, и фаголизис — разрушение клеток под воздействием фагов.

Автолиз. Для разложения клеточных стенок собственными протеолитическими ферментами клетки необходимо сначала осуществить шоковое воздействие или величиной рН (обычно закислением), или температурой, или затравочной дозой таких реагентов, как толуол, хлороформ, этилацетат, олеиновая кисло­та. Далее процесс автолиза протекает при температуре, свой­ственной данному виду микроорганизмов. Например, автолиз дрожжей происходит при 45—50 С. Надо отметить," что это до­вольно длительный процесс (12—24 ч).

Ферментолиз. Недостатки автолиза привели к использованию интродуцируемых в суспензию внеклеточных ферментов, вызыва­ющих лизис клеточной стенки. Исходя из рассмотренного ранее состава клеток, такими ферментами могут быть протеазы, гликаназы, манназы и иногда лизоцим, представляющий собой комплекс различных ферментов.

Для этих целей эффективно применение иммобилизованных ферментов, которые можно использовать многократно.

Получаемые при автолизе и ферментолизе растворы часто со­держат легкоусвояемые вещества (белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты и др.). Поэтому автолизаты и ферментолизаты — не просто полупродукт для выделения внутриклеточных составля­ющих, но также могут быть хорошим кормовым продуктом. Он особенно подходит для молодняка рыб и животных, которые еще не приспособились своими ферментами переваривать клеточные оболочки и разрушать их.

Клеточные оболочки, также являющиеся продуктом процесса дезинтеграции, могут быть отделены от раствора, высушены, пос­ле чего их вполне можно использовать как хороший сорбент для вредных примесей в пищевых продуктах или как тот же корм для животных.

Добавление пенициллина. Биохимическая основа действия пени­циллина на микробные клетки — это торможение синтеза нового материала клеточной стенки. В результате стенка истончается за счет собственного всегда идущего автолиза и становится проница­емой для внутриклеточных биополимеров.

Фаголизис. Известно «вирусное заболевание» микробных куль­тур, вызываемое фагом. Его отличительным свойством является как раз лизис микробных клеток, т. е. вроде бы то, что нам нужно при дезинтеграции.

Теоретически такую возможность себе можно представить. Однако последствия заражения фагом производственных ферментеров настолько велики, что в практике такая возможность выглядит примерно как способ устранения головной боли с по­мощью гильотины.

Несмотря на большое разнообразие рассмотренных методов, следует признать, что в промышленных условиях наиболее перс­пективно применение методов лизиса — с использованием либо мягких химических реагентов, либо ферментативных. Другие ме­тоды имеют лишь вспомогательное значение для опытов в лабора­тории.

Вопросы для повторения

.1. Каково основное назначение дезинтеграции клеток микроорганизмов? По-ясните отличие дезинтеграции от стерилизации и измельчения.

2.  Каковы особенности клеточных стенок бактерий, дрожжей, грибов, живот-ных и растительных клеток?

3.  Назовите виды клеток в порядке возрастания чувствительности к механи-ческим воздействиям.

4.  Что такое баллистическая дезинтеграция? Назовите ее достоинства и недо-статки.

5. Что такое декомпрессионная дезинтеграция? Назовите движущую силу это-го процесса.

6.  Что является причиной разрушения клеток при экструзионной дезинтегра-ции?

7.  Как влияют концентрация клеток и давление на эффективность баллисти-ческой дезинтеграции?

8.  Чем отличаются ферментативные методы дезинтеграции от автолиза?

9.  Каковы затраты энергии на механическую дезинтеграцию клеток микроор-ганизмов?

10.  За счет каких факторов происходит дезинтеграция клеток при их замора-живании и последующем оттаивании?

11.  Какие методы дезинтеграции наиболее эффективны в крупномасштабном промышленном производстве?

Лекция № 11  Экстракционные методы выделения продуктов метаболизма.

1. Традиционные методы экстрагирования продуктов из биомассы

2. Экстрагирование «суперкритическими» жидкостями

3. Жидкофазная центробежная экстракция

Экстракционные методы вьщеления продуктов, используемые в биотехнологии, подразделяются на две основные группы: методы экстрагирования, когда целевой продукт извлекается жидкостью (экстрагентом) из твердой фазы (рафината) — чаще всего биомассы микроорганизмов, и методы жидкостной двухфазной экстракции, в которой продукт, растворенный в жидкой фазе (рафинате), извлекается друтой жидкостью (экстрагентом) — обычно это органичесюий растворитель. В обоих случаях фаза, из которой выделяется продукт, называется рафинат, жидкая фаза, служащая агентом процесса экстракции, называется экстрагент, эта же фаза после перехода в нее растворенного вещества называется экстракт. Твердую фазу (рафинат) после извлечения из нее растворенного вещества называют шрот.

1. ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ЭКСТРАГИРОВАНИЯ ПРОДУКТОВ ИЗ БИОМАССЫ

Экстрагирование из биомассы клеток. Некоторые из продуктов метаболизма можно выделить из биомассы без разрушения кле-точных стенок (липиды, некоторые ферменты). В большинстве же случаев используют сначала рассмотренные ранее способы дезин-теграции клеток и экстрагированию лодвергают дезинтеграт — разрушенные клетки или их оболочки. Экстрагирование применяется для извлечения ферментов из ?ультур грибов, выращенных твердофазной ферментацией, микробного жира или липидов из биомассы дрожжей, антибиотиков и полипептидов, локализован-ных на клетках микроорганизмов, при выделении внутриклеточ-ных биополимеров типа белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т. д.

Всегда за экстрагированием следует стадия отделения твердой фазы, в результате чего извлекаемое вещество переводится в жидкую фазу — экстракт, из которого в дальнейшем и выделяют продукт.

В качестве экстрагентов в зависимости от вида извлекаемого вещества используются: вода, водные растворы кислот или щелочей, органические растворители — спирты, ацетон, нефрас (смесь легких углеводородов).

Существует несколько способов осуществления экстрагирования: экстрагирование с перемешиванием, экстрагирование в неподвижном слое, экстрагирование одно - и многоступенчатое, прямоточное и противоточное.

Экстрагирование с перемешиванием является наиболее простым способом экстрагирования. В аппарат с мешалкой загружается твердая фаза (биомасса после сгущения или отделения на фильт-ре) и жидкая фаза (экстрагент). Процесс далее протекает при перемешивании.

Концентрация растворенного вещества в биомассе после однократного экстрагирования существенно меньше, чем перед ним. Эта величина тем меньше, чем больше коэффициент распределения ужт и чем больше соотношение объемов жидкости и твердой фазы Уж / Ут.

Кстати, отсюда же видно, что на конечную величину концентрации не влияет коэффициент массоотдачи Ку, он лишь ускоряет или замедляет процесс экстрагирования, но итоговый результат одинаковый.

Чтобы повысить концентрацию вещества в экстракте, стараются не слишком увеличивать отношение ?ж к ?,

Лучше сначала отделить твердую фазу от экстракта и провести повторно экстрагирование свежим растворителем. Так можно делать несколько раз, а затем объединить экстракты. Это будет лучше для полноты извлечения, чем сразу однократно добавить весь объем экстрагента. В этом заключается смысл многоступенчатого, или многократного, экстрагирования.

Еще лучше использовать противоточное экстрагирование: свежую биомассу с наиболее высокой концентрацией извлекаемого вещества соединяют с экстрактом, полученным после двух-трех операций экстрагирования, а биомассу после 2-го или 3-го экстрагирования — со все более чистым экстрагентом (рис. 15.3).

На схеме не отмечено, но предполагается, что после каждой стадии происходит разделение жидкой и твердой фаз.

Экстрагирование в неподвижном слое используется в том случае, когда биомасса уже предварительно высушена. Она загружается в колонны или патроны (диффузоры), через которые  проходит жидкий экстрагент. Обычно используют батарею из 20 или более последовательно соединенных диффузоров (рис. 15.4).

По мере исчерпания веществ в диффузорах производят пере-ключение патронов и их перезагрузку, Свежий патрон (по биомассе) является последним по ходу потока экстрагента. Происходит как бы ступенчатое движение биомассы (без ее отделения от жидкости, как в экстрагировании с перемешиванием).

Организация межфазной поверхности. Массоотдача локализованного в биомассе вещества от порошка биомассы к жидкости в аппарате — не самый лучший способ экстрагирования. При этом образуются агломераты биомассы, в результате чего не все клетки оказываются доступными для экстрагента. Кроме того, для повы-шения коэффициента массоотдачи важно повысить относитель-ную скорость движения биомассы и жидкой фазы.