Молекулярно-клеточные и патоморфологические особенности в злокачественных лимфомах при проявлении опухолевой прогрессии в условиях полихимиотерапии (экспериментально-клиническое исследование) (стр. 2 )

2. В условиях влияния опухолевого процесса и проведения многокурсовой полихимиотерапии нарастают деструктивные изменения в паренхиме печени животных и происходит «истощение» синтеза цитохрома Р450 в гепатоцитах, что снижает чувствительность опухоли к цитостатикам и повышает токсическую нагрузку на организм.

3. Проведение многократных курсов полихимиотерапии пациентам с диффузной В-крупноклеточной лимфомой в процессе лечения заболевания приводит к изменениям молекулярных характеристик лимфомных клеток, отражающих опухолевую прогрессию: в леченой опухоли в сравнении с первичной диффузной В-крупноклеточной  лимфомой происходит блок процессов апоптоза и активация множественной лекарственной устойчивости, что способствует прогрессированию опухолевого процесса у пациентов, снижает чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии, способствует увеличению опухолевой массы, повышению токсической нагрузки.

Степень достоверности и апробация результатов исследования. Материалы исследования  представлены на ежегодной конкурс-конференции «Авиценна» (Новосибирск, 2010, 2012), на всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011), межвузовской научной студенческой конференции «Интеллектуальный потенциал Сибири» (Новосибирск, 2012), первой всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине ХХI века» (Москва, 2012), на научно-практической конференции патологоанатомов ДВФО посвященной 100-летию со дня рождения профессора «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Хабаровск, 2012), на научно-практической конференции Южного Урала (Челябинск, 2014).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую деятельность на  кафедрах патологической анатомии и гистологии, эмбриологии, цитологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ и в научно-исследовательскую деятельность лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2– в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК для публикаций материалов диссертационных  исследований, 1 статья в зарубежном издании.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 36 рисунками и содержит 3 таблицы. Библиографический указатель содержит 185 источников, из которых 45 отечественных и 140 зарубежных работ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные животные. В данной работе были использованы 14-16-недельные мыши-самцы линии CBA/LacSto из вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в виварии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН в соответствии с правилами принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург,1986) в стандартных условиях: при обычном световом режиме, в пластиковых боксах со стандартным пищевым рационом и имели свободный доступ к воде и пище. Протокол Экспериментов был согласован с комитетом по этике Новосибирского государственного медицинского университета (протокол ).

Опухолевая модель.  В лаборатории нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН совместно с сотрудниками лаборатории регуляции экспрессии генов ИЦГ СО РАН была разработана модель лимфоидной опухоли  RLS, имеющая фенотип множественной лекарственной устойчивости, сформированная путем многократного перевивания рецидивов этой опухоли, возникающих после воздействия низких доз циклофосфана при постепенном их повышении (от 10 до 200 мг/кг) и характеризовался пониженной чувствительностью к действию циклофосфана ( и др., 2006). По морфологическим характеристикам и особенностям течения опухоль RLS соответствует агрессивным В-клеточным лимфоидным опухолям, к которым относится ДВККЛ у людей, а также опухолям, которые уже подвергались воздействию цитостатиков.

Эксперимент № 1. На первом этапе эксперимента целью было изучить выживаемость животных с перевитой в разных дозах опухолью RLS без воздействия ПХТ. Опухолевые клетки RLS в концентрации 5 Ч 104 клеток/мл  в 0,3 мл физиологического раствора были пересажены внутрибрюшинно экспериментальным животным. На десятый день развития опухоли физиологический раствор (0,5мл) был введен внутрибрюшинно животным и собран вместе с асцитом (0,5-0,8 мл) с помощью шприца. Далее полученную асцитную жидкость разбавляли до 5 мл PBS-буфером (фосфатный солевой буфер) и центрифугировали с 3 мл среды Lymphocyte Separation Medium (LSM) при 1500 об/мин в течение 15 минут, фракцию мононуклеарных клеток, находящуюся на границе раздела LSM и супернатанта, переносили в чистую пробирку с 5-7 мл фосфатного буфера PBS, суспендировали и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут. Клеточный осадок подсчитывали с помощью камеры Горяева и перевивали нужное количество экспериментальным животным. Животные были поделены на четыре группы, 5 мышей в каждой, которым была перевита внутримышечно в правое бедро лимфома RLS. В первой группе животным перевили суспензию клеток опухоли RLS в 0,1 мл физиологического раствора по 100 тыс. кл/мл, во второй группе - 80 тыс. кл/мл, третей группе - 50 тыс. кл/мл, четвертой по 20 тыс кл/мл, оценивая динамику роста опухолевого узла.

Эксперимент № 2. Целью второго этапа явилось проведение животным с перевитой опухолью RLS многократных курсов химиотерапии. Мышей делили на две группы, в первой группе 80 животных, во второй 20. Животным обеих групп внутримышечно в правое бедро трансплантировали суспензию клеток опухоли RLS в физиологическом растворе (2х105 кл/мл). На 7-е сутки роста опухоли  первой группе животных вводили комбинацию цитостатиков, аналогичную схеме CHOP для лечения гемобластозов, второй группе лекарственные препараты не вводили (контроль). Препараты вводили в дозировках, соответствующих 1/5 ЛД50: циклофосфан – 50 мг/кг массы тела, доксорубицин – 4мг/кг и винкристин – 0,1 мг/кг однократно в хвостовую вену, преднизолон – 5 мг/кг - внутрибрюшинно.

На 7 сутки после проведения 1 курса ПХТ часть животных выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Далее животное препарировали, отделяли верхний пласт опухолевой ткани и помещали его в физиологический раствор для приготовления первичной культуры. Оставшимся животным из 1 группы через 7 суток проводили 2 курс ПХТ, часть животных выводили из эксперимента для последующего приготовления первичной культуры. Оставшимся животным по той же схеме через каждые 7 суток проводили последовательно 3 и 4 курсы ПХТ. Забор материала для гистологического исследования проводили на 1-е, 3-и, 7-е сутки после каждого курса ПХТ, после проведения 4 курса - забор материала производили только на 1-е сутки. Забор материала для проведения молекулярно-биологического исследования производили на 7-е сутки после каждого курса ПХТ, после проведения 4 курса - материал забран на 1-ые сутки.

Во второй экспериментальной группе наблюдали развитие и прогрессирование опухолевого процесса без лечения, забор материала для морфологического и молекулярно-биологического исследования проводили на тех же сроках, что и в первой группе.

В результате продолжительность эксперимента составила 30 суток, в течение которых удалось провести максимально 4-е курса ПХТ.

Оценка эффективности ПХТ и динамика роста опухоли. Динамику роста перевитой опухоли оценивали проводя замеры пораженной конечности при помощи штангенциркуля: полученные три взаимно перпендикулярные размера перемножали и получали объем опухоли (см3). Регулярно проводили взвешивание животных, чтобы оценить токсическое действие опухоли и химиотерапии на организм животных.

Клиническая часть. Лимфатические узлы с опухолевым ростом НХЛ выбрали из архивного материала от пациентов Городского гематологического центра ГКБ №2 г. Новосибирска (гл. врач д. м.н. ).

В исследование были отобраны гистологические блоки лимфатических узлов случаев неспецифицированного варианта нодальной диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) (WHO classification lymphoid tumor, 2008), относящейся к НХЛ с агрессивным характером течения.

Были сформированы 2 группы пациентов: 1 группа - операционно-биопсийный материал лимфатических узлов 30 пациентов с первично выявленной ДВККЛ (средний возраст пациентов составил 52,3±3,7) и 2 группа - гистологические материалы лимфатических узлов с рецидивом ДВККЛ - по аутопсийному материалу от 20 пациентов с ДВККЛ, перенесших от 16  до 24 курсов  ПХТ суммарно и умерших в стационаре на этапе лечения очередного рецидива данного заболевания (средний возраст пациентов 57,1±2,9). 

Морфологические методы, используемые в работе

Гистологическое исследование: ткань опухоли и органы экспериментальных животных фиксировали в 10% забуференном формалине (Biovitrum, Россия) в течение 3-6 дней, далее для гистологической проводки вырезали фрагменты опухоли и органов толщиной 3-5 мм. Затем производили обезвоживание материала в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле, заключали в парафин. Далее на ротационном микротоме изготавливали срезы толщиной 3-5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином.

Для проведения гистологического исследования архивный материал лимфатических узлов пациентов с опухолью перезаливали в парафин Leica, пропитывали в парафине в течение 1 часа при 56оС, формировали новые блоки, из которых на микротоме изготавливали срезы толщиной 3- 5 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Дополнительно на предметные стекла, покрытые адгезивом, помещали срезы для иммуногистохимического исследования.

Иммуноморфологическое исследование: выполняли в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководствах по иммуногистохимическим исследованиям (Buchwalow I., 2010; Dabbs J., 2010; , 2012), рекомендациями фирм-производителей антител. Для окрашивания тканей животных использовали антитела: Ki-67 (клон SP6), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; BCL-2 (клон SP66), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; Cytochrome P450 (2D6), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия; Caspase 3 (клон ab4051), rabbit polyclonal, «Thermo Scientific», USA; р53 (клон SP5), rabbit monoclonal, «Spring Bioscience», USA; P-glycoprotein antibody (клон С219), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия.