Для окрашивания лимфатических узлов пациентов с ДВККЛ использовали антитела: Ki-67 (клон MIB1) mouse monoclonal, «DAKO» Дания; BCL-2 (клон 124), mouse monoclonal, «DAKO» Дания; р53 (клон DO-7), mouse monoclonal, «DAKO» Дания; P-glycoprotein antibody (клон С219), rabbit polyclonal, «Abcam», Англия. Оценка полученного иммуногистохимического исследования проводилась полуколичественным методом. При исследовании препаратов окрашенных антителами, рассчитывали индекс мечения (ИМ) – отношение числа позитивно окрашенных клеточных структур на 100 опухолевых клеток.

Морфометрическое исследование: проводили, используя основные принципы стереологии и морфометрии (, 1990).

Определение уровня экспрессии генов mdr1a, mdr1b, bcl-2, p53 с помощью метода ОТ-ПЦР

Из первичной культуры опухолевых клеток RLS выделяли суммарную клеточную РНК с помощью стандартной SDS/фенольной экстракции. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически, сохранность выделенной РНК проверяли с помощью электрофореза в 1%-ой агарозе. кДНК синтезировали с использованием выделенной суммарной клеточной РНК, рандомизированного гексануклеотидного праймера и обратной транскриптазы M-MLV. Далее проводили амплификацию с парами праймеров к генам mdr1a, mdr1b, bcl-2, p53 и β-актину, выбранных с использованием программы OLIGOS и синтезированных в технологической лаборатории ИХБФМ СО РАН. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 8%-ом полиакриламидном геле. Полученные изображения полос обрабатывали с помощью компьютерной денситометрии (Gel-Pro Analyzer 4.0).

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Статистический анализ. Полученные цифровые данные были подвергнуты статистическому анализу с использованием прикладных программ OriginPro 5.5., Microsoft Office Excel 2010 и пакета статистических программ Statistica v. 7.0 (StatSoft Inc., USA). Показатели исследования были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. В случае нормального распределения значений применяли t-критерий Стьюдента и дисперсионный анализ с использованием метода множественных сравнений. Результаты представлены в виде M±m, где M– средняя арифметическая величина, m – стандартная ошибка средней ( 1999; 2007). Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем достоверной вероятности 95% (р< 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Модель экспериментальной  лимфосаркомы мышей RLS. Оценка опухолевой прогрессии у  экспериментальных животных в зависимости от количества курсов ПХТ

В результате первого эксперимента была обоснована доза имплантации опухоли – 20 тыс. кл., когда опухоль росла относительно медленно, что обеспечивало максимальную продолжительность жизни животных. Установленная динамика роста опухоли дала возможность провести несколько курсов введения комплекса цитостатиков на мышах-опухоленосителях, что максимально приближено к клинической картине у пациентов с гемобластозами.

Гистологическое строение перевиваемой лимфомы RLS и морфологические особенности ткани опухоли в зависимости от числа курсов ПХТ

Макроскопически в бедре формировался  округло-овальный опухолевый узел, бело-розового цвета, который микроскопически  был построен из крайне полиморфных крупных атипичных лимфоидных клеток с узким ободком цитоплазмы. Ядра клеток с большим количеством патологических митозов, встречалось большое количество клеток в состоянии апоптотического распада.

Опухоль росла инвазивно и разрушала окружающие мышцы бедра, наблюдали метастазы опухолевых клеток в печень, почки и легкие, ткани передней брюшной стенки, у одного животного метастазы выявлены в перикарде.

Влияние ПХТ на динамику роста лимфомы мышей RLS и продолжительность жизни животных с опухолью

У всех животных на 7-е сутки после трансплантации опухолевых клеток в бедре формировался солидный опухолевый узел, достигавший среднего объема около 0,16 см3, далее размеры узла поступательно увеличивались, несмотря на повторяющиеся курсы ПХТ. У животных с перевитой опухолью в группе без воздействия ПХТ, начало гибели животных отмечали на 18-е сутки после трансплантации опухолевых клеток и их средняя продолжительность жизни составила 26,6 суток. В группе животных-опухоленосителей с проведением 4-х последовательных курсов ПХТ с интервалом в 7 дней гибель животных начиналась к 25-м суткам после трансплантации опухоли их средняя продолжительность жизни составила 28 суток. Максимальный размер опухолевого узла достигал  4±0,26 см в группе животных с опухолью без лечения и 1,6±0,15 см в группе животных получавших лечение цитостатиками. Отсутствие редукции опухоли  RLS на фоне введений комплекса цитостатиков потребовало уточнения механизмов прогрессирования опухолевого процесса в изначально резистентной опухоли.

Определение уровня экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, в клетках опухоли RLS после воздействия нескольких курсов ПХТ

Было установлено, что по сравнению с опухолью без лечения, после воздействия четырех курсов ПХТ в клетках опухоли RLS повысилась экспрессия генов mdr1b (в 1,8 раза) и bcl-2 (в 1,3 раза), уровень экспрессии гена mdr1a снижался в 1,2 раза, а экспрессия гена р53 различалась по курсам ПХТ и к 4 курсу произошло снижение показателя почти в 2 раза (рис.1). Повышение уровня экспрессии гена mdr1b, свидетельствует, что МЛУ продолжает нарастать в опухоли RLS с селекцией еще более лекарственно устойчивого клона опухолевых клеток. Полученные результаты динамики экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, вызвали интерес сравнить эти данные с уровнем кодируемых этими генами белков.

   

   

Рис.1 Уровни экспрессии генов mdr1a, mdr1b, bcl-2 и p53 в клетках опухоли RLS без лечения и в опухоли RLS после проведения четырех курсов ПХТ.

Результаты исследования индекса мечения окрашенных Ki-67 опухолевых клеток в лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения ПХТ

       Проведение 4 курсов ПХТ сопровождалось увеличением экспрессии Ki-67 в опухолевых клетках RLS: до проведения ПХТ индекс мечения составил 34,0 ± 0,95, после проведения 1 курса ПХТ он возрос на 17,6 % и составил 40,0± 1,37, затем продолжал повышаться и к 4 курсу ПХТ возрос до 51,0±1,13%. Даже на фоне курсов ПХТ изначально резистентная к цитостатикам лимфома RLS продемонстрировала опухолевую прогрессию за счет интенсификации пролиферативного режима, что предполагает возможное формирование вторичных мутаций генома, обеспечивающих выживание опухолевых клеток.

Уровень некрозов и апоптозов в экспериментальной лимфоме RLS без лечения и после курсов ПХТ

В группе животных с перевитой опухолью RLS, но без проведения химиотерапии появление некрозов было зафиксировано к 7-м суткам роста опухоли, когда объемная плотность некрозов составила 2,5%, к 14-м суткам доля некрозов в опухоли увеличилась до 9%.

В динамике роста опухоли RLS на фоне проведения курсов ПХТ объемная плотность некрозов также нарастала. Появление некрозов отмечали на 3-и сутки после первого курса ПХТ - доля их была невелика и составила в среднем около 1%. После 2 курса ПХТ некрозы были зафиксированы уже через 1 сутки (8,7±1,92), к 3-м суткам объемная плотность некрозов составляла уже 18,0±3,41, достигнув показателя 22,0±3,95 к 7-м суткам. Третье введение комплекса цитостатиков индуцировало некротические процессы более интенсивно - они занимали до 20% ткани опухоли через 1 сут и этот показатель существенно не изменялся через 3 и 7 суток  после 3 курсов ПХТ и был на таком же уровне уже через 1 сутки после 4 курса ПХТ.

При оценке выраженности процессов апоптоза в опухолевой ткани было установлено: в опухоли до лечения на 7-е сутки роста RLS численная плотность апоптозов составляла 1,2±0,10, а к 14 суткам отмечали снижение показателя до 0,96±0,10 (на 20%).

В опухоли животных после проведения курсов ПХТ отмечали  возрастание показателя численной плотности клеток опухоли в состоянии апоптоза - к 7 суткам после 1-го курса ПХТ он повысился почти в 2 раза (1,01±0,1) по сравнению с 1 сутками и далее наблюдали незначительное увеличение численной плотности апоптозов в опухоли с каждым последующим курсом химиотерапии. После 3 курса ПХТ уровень апоптозов составил через 1-и сутки 1,2±0,09, через 3-е и 7суток показатель оставался на этом же уровне, а через 1 сутки после проведения 4 курса ПХТ имел максимальное значение - 1,3±0,1.

Численная плотность апоптозов в опухоли также нарастала незначительно на фоне нестабильной динамики экспрессии гена р53. При этом отмечали возрастание пролиферативной активности опухоли и прогрессирующий рост размеров опухолевого узла.

В связи с отмеченными сложными особенностями молекулярных характеристик опухоли RLS в динамике 4 курсов ПХТ было целесообразным оценить уровень экспрессии каспазы 3 в клетках лимфомы RLS до лечения и после введения комплекса цитостатиков.

Результаты исследования индекса мечения окрашенных caspase 3 опухолевых клеток в экспериментальной лимфоме мышей RLS без лечения и после проведения курсов ПХТ

В результате исследования было отмечено незначительное изменение ИМ caspase 3 на фоне 4-х курсов ПХТ. В группе животных с опухолью без ПХТ 12,6±0,32% опухолевых клеток экспрессировали данный белок, что отражает имеющийся уровень спонтанного апоптоза в опухоли в результате грубых генетических аномалий и ишемии. В группе животных после проведения 1 курса ПХТ  ИМ возрос незначительно – на 7,1 % и составил 13,5±0,32%, после 2-го курса ПХТ – 15,7±0,35%. После проведения 3-го и 4-го курсов ПХТ уровень экспрессии опухолевыми клетками каспазы 3 существенно не менялся и составил 16,0±0,32% и 15,8±0,33% соответственно. 

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5