Молекулярно-клеточные и патоморфологические особенности в злокачественных лимфомах при проявлении опухолевой прогрессии в условиях полихимиотерапии (экспериментально-клиническое исследование) (стр. 4 )

Таким образом, было установлено, что при имеющемся в опухоли RLS без лечения невысоком уровне экспрессии каспазы 3 повторяющиеся курсы введения комплекса цитостатиков против ожидаемого приводили к несущественному увеличению экспрессии эффекторной каспазы. Это обстоятельство в совокупности с выявленным повышением экспрессии антиапоптотического гена bcl-2 (в 1,3 раза) и снижение уровня экспрессии гена р53 (почти в 2 раза к 4-му курсу ПХТ) свидетельствует о том, что в опухоли RLS цитостатики индуцируют апоптотическую гибель опухолевых лимфоидных клеток очень незначительно.

Из полученных результатов можно предположить, что изначально резистентная к цитостатикам опухоль RLS прогрессирует по крайне неблагоприятному сценарию: процессы апоптоза, которые должны индуцироваться введением комплекса цитостатиков, нарушены, параллельно отмечено повышение пролиферативной активности клеток RLS. По-видимому, на фоне курсов ПХТ происходит клональная селекция клеток, имеющих механизмы выживания, и накопление дополнительных генетических мутаций, что в итоге обусловливает развитие преимущественно спонтанного, а не лекарственно-индуцированного апоптоза и некроза.

Результаты исследования индекса мечения окрашенных на Р-гликопротеин опухолевых клеток экспериментальной лимфомы мышей RLS  без лечения и после проведения курсов ПХТ

В группе животных без ПХТ 31,1±1,37% опухолевых клеток экспрессировали р-гликопротеин, что в совокупности с изначально высоким уровнем экспрессии гена mdr1b в RLS свидетельствует об первично имеющейся индукции процессов МЛУ в данной агрессивной лимфоидной опухоли. У животных, получивших 4-х кратное введение цитостатиков, уровень ИМ Р-гликопротеина в опухолевых клетках поступательно увеличивался: составил  49,0±1,10% после проведения 1-го курса ПХТ, 56,2±1,15% – после 2-го курса ПХТ, а после 3-го и 4-го курса - 62,0±1,17% и 64,7±1,05% соответственно. 

В группах экспериментальных животных и в опухолевых клетках пациентов наблюдали значительное нарастание экспрессии данного белка в динамике ПХТ, что может подтверждать высказанное  предположение о проявлении в клетках опухоли RLS эволюционно выработанного механизма, защищающего от повреждающих агентов.

В связи с вышесказанным представило интерес оценить структурно-функциональные изменения в печени на фоне повышения злокачественности опухоли, индукции процессов МЛУ и снижения чувствительности к цитостатикам, т. к. именно в ней происходит метаболизм химических веществ.

Структурные изменения ткани печени и результаты исследования индекса мечения окрашенных на цитохром P450 гепатоцитов у животных с RLS до лечения и после проведения курсов ПХТ

В печени у животных с ростом перевитой в бедро лимфомы RLS было нарушено балочное строение ткани, определялись внутридольковые очаговые некрозы разного размера (от моноцеллюлярных до очаговых). Дистрофия  гепатоцитов имела характер белковой (вакуольной или гидропической), в синусоидах встречались лимфоциты, единичные нейтрофилы, макрофаги. У большей части животных в ткани печени, преимущественно периваскулярно вокруг центральной вены, обнаруживали метастазы ткани опухоли.

В группе животных, которым провели 4 курса ПХТ, отмечали нарастание деструктивных изменений в ткани печени. Так после проведения 4-го курса ПХТ объемная плотность некрозов гепатоцитов увеличилась в 1,6 раза по сравнению с показателем после 1 курса ПХТ и почти в 3,5 раза - по сравнению показателем в группе животных с лимфомой RLS без лечения.

Доля дистрофических изменений гепатоцитов так же нарастала: на 1-е сутки после проведения 1 курса ПХТ показатель составил 23,0±0,55, а на этот же срок после проведения 4-го курса химиотерапии - 34,84±0,85, т. е. произошло увеличение объемной плотности гепатоцитов в состоянии дистрофии в 1,5 раза.

Количество двуядерных гепатоцитов, которые отражают регенераторный потенциал печени, снижалось от курса к курсу проведения химиотерапии, от значения 2,2±0,16 до лечения, до значения 1,1±0,08 после 4-х курсов ПХТ,  что свидетельствует о снижении активности репаративных процессов в органе на фоне нарастания лекарственной устойчивости опухоли и нарушения синтеза ДНК в гепатоцитах цитостатиками.

Также изменение метаболизма цитостатиков и их распределения  могло происходить за счет гиперэкспрессии белкового продукта гена MDR1 - трансмембранного белка Р-гликопротеина, который обладает функцией выведения ксенобиотиков из клетки во внеклеточную среду. Таким образом, активация данного механизма могла привести к циркуляции в системном кровотоке высоких концентраций химиопрепаратов, а, соответственно, повреждению токсическими веществами органов и тканей.

Кроме того, развитие злокачественного опухолевого процесса сопровождается развитием тканевой гипоксии, в результате которой замедляется биотрансформация ксенобиотиков, а также повышается выраженность их токсических эффектов и снижается терапевтическая эффективность. Ключевую роль в трансформации ксенобиотиков играет  система Р450-зависимых монооксигеназ, изучение показателей активности которых в клинике, позволит учитывать особенности трансформации экзогенных субстратов организмом каждого пациента индивидуально.

У животных с RLS до лечения цитохром Р450-позитивные клетки в печени определялись преимущественно в центральных отделах дольки в виде очаговых скоплений, ИМ составил 19,9±1,36. Далее на фоне последовательных курсов ПХТ он начинал снижаться от курса к курсу. После 1-го курса ПХТ ИМ составил 11,0±0,86, после второго курса - 7,0±0,56. После третьего и четвертого курсов введения цитостатиков уровень экспрессии цитохрома P450 продолжал снижаться и достиг 2,0±0,25% и 1,7±0,16% соответственно. Т. о. количество цитохром Р450-позитивных клеток снизилось почти в 11 раз после проведения 4-ого курса ПХТ по сравнению с опухолевыми животными, которые не получали цитостатики.

Исследование опухолевой прогрессии диффузной В-крупноклеточной лимфомы у пациентов в процессе полихимиотерапии: сравнительная молекулярно-клеточная характеристика  опухоли у пациентов до лечения и после курсов химиотерапии по поводу рецидивов

Полученные данные об изменении основных  биологических характеристик клеток опухоли мышей RLS под воздействием повторяющихся курсов введения комплекса цитостатиков вызвали интерес соотнести с происходящими изменениями в злокачественных формах НХЛ у пациентов с первично выявленной ДВККЛ и у пациентов с рецидивом данного заболевания на фоне многократных курсов ПХТ.

Оценивая ИМ окрашенных ядер опухолевых клеток антителами к Ki-67 было выявлено, что в группе пациентов с первично диагностированной ДВККЛ уровень пролиферативной активности опухолевых клеток изначально был высоким и составил 56,3 ± 1,5%, что отражает высокую агрессивность данного варианта НХЛ. В опухоли онкобольных, перенесших многокурсовую ПХТ и умерших при очередном рецидиве болезни, уровень пролиферативной активности опухоли снижался в 1,5 раза, несмотря на очевидное прогрессирование заболевания с вовлечением в опухолевый процесс мультилокализаций. Учитывая, что у умерших пациентов данный показатель оценивали непосредственно на этапе лечения ДВККЛ цитостатиками, можно предположить, что снижение уровня экспрессии Ki-67 отражает долю «выживших» пролиферирующих опухолевых клеток, являющихся наиболее устойчивыми к антибластомным средствам.

ИМ онкопротеина BCL2 изначально был достаточно высоким у пациентов с первично возникшей опухолью - 47,4±2,4 %, а у пациентов с рецидивами после полученного цитостатического лечения отмечали дополнительное нарастание этого показателя в 1,7 раза, ИМ p53 так же повышался у пациентов перенесших рецидивы заболевания и многократные курсы ПХТ - показатель увеличился в 2,3 раза по сравнению с аналогичным показателем в группе больных с первично возникшей опухолью.

Оценка ИМ р-гликопротеина установила, что 22,1 ±0,58% опухолевых клеток пациентов с впервые выявленной ДБККЛ экспрессировали данный белок, у пациентов с рецидивами, получивших терапию цитостатиками, показатель возрос в 1,7 раза и  составил 36,6±1,1%. Таким образом, наблюдали значительное нарастание экспрессии Р-гликопротеина в опухолевых клетках пациентов после проведения курсов лечения цитостатиками, что может свидетельствовать о проявлении опухолевыми клетками эволюционно выработанного механизма защиты от повреждающих агентов, в данном случае - это воздействие комплекса химиотерапевтических препаратов. В результате цитостатики «выбрасываются» из опухолевых клеток, тем самым снижается эффективность лечения и усиливается  токсическая нагрузка на органы и ткани.

Полученные данные свидетельствуют о том, что проведение противоопухолевого лечения комплексом цитостатиков изменяет молекулярный «портрет» ДВККЛ – опухолевая ткань приобретает негативные характеристики, отражающие опухолевую прогрессию.

ВЫВОДЫ

1. На модели резистентной к цитостатикам лимфомы RLS мышей показано, что опухолевый узел на фоне проведения 4 курсов полихимиотерапии рос медленнее по сравнению с группой животных с опухолью RLS не получавших ПХТ, при этом регрессии опухолевого узла не было отмечено ни на одном курсе химиотерапии. Прогрессирующее увеличение  размеров опухолевого узла от курса к курсу сопровождалось следующими молекулярно-клеточными и  патоморфологическими изменениями, в совокупности отражающими приспособление опухолевых клеток к химиотерапевтическому воздействию:

а) численная плотность апоптозов опухолевых клеток нарастала незначительно, что в совокупности с невысоким количеством клеток, экспрессирующих каспазу 3, отражает сформировавшееся нарушение проапоптотической функции гена р53;

б) в опухоли на фоне  введения комплекса цитостатиков происходило нарастание объемной плотности некрозов, достигающее максимальных значений после 4 курса полихимиотерапии (20%);

в) проведение полихимиотерапии сопровождалось постепенным увеличением количества Ki-67-позитивных клеток RLS в сравнении с показателем в опухоли до лечения, что коррелировало с интенсивным ростом опухоли на фоне химиотерапии.

2. В опухоли RLS при проведении химиотерапии происходила селекция еще более лекарственно устойчивого клона опухолевых клеток, что проявлялось в повышении экспрессии генов mdr1b и bcl-2, а экспрессия гена р53 была нестабильной и снижалась 1,8 раза после последнего курса химиотерапии, что подтверждает сформировавшийся блок процесса  апоптоза в опухоли.