Учебно-методический комплекс дисциплины «Медико-биологические полимеры» (стр. 4 )

Применяемые в медицине противоопухолевые ФАВ эффек­тивно уничтожают опухолевые клетки, однако почти столь же сильно они воздействуют и на нормальные клетки. Недостаточ­ная терапевтическая широта как следствие высокой и не изби­рательной токсичности в применяемых дозах представляет со­бой основное препятствие при химиотерапии опухолей. Для его преодоления необходим целенаправленный транспорт противо­опухолевых ФАВ преимущественно в опухолевые клетки — создание транспортных форм цитотоксичных веществ, обладающих повышенным сродством к опухолевым клеткам и возможностью проникать в них.

Противоопухолевое ФАВ может быть непосредственно сое­динено с лигандом, специфичным в той или иной мере для опу­холевых клеток данного вида. Однако выгоднее соеди­нять эти два компонента через полимер-носитель, что ограничи­вает распространение токсичного ФАВ и позволяет использо­вать свойства самого полимера: склонность к эндоцитозу, регулируемые заряд и М, кооперативные взаимодействия и т. д. В общей форме механизм действия прививочных ФАП, со­держащих противоопухолевые ФАВ, выглядит так. ФАП свя­зывается с клетками в соответствии со своим суммарным заря­дом и гидрофильно-липофильным балансом, а также с помощью биоспецифического лиганда, если он есть, после чего подверга­ется эндоцитозу. В результате переваривания в лизосомах происходит внутриклеточное выделение действующего начала, приводящее к гибели данной клетки. Таким образом, роль полимера-носителя заключается в данном случае в целе­вом транспорте и облегчении проникновения ФАВ в быстро эндоцитирующие, в том числе опухолевые, клетки.

  4. Среди систем организма, предназначенных для инактивации и выведения чужеродных химических соединений (ксенобиоти­ков), иммунная система «специализируется» на полимерах и более крупных частицах — вирусах, микроорганизмах и т. д. Многие чужеродные полимеры при попадании внутрь организ­ма вызывают иммунный ответ, направленный на нейтрализа­цию и выведение антигенов. В осо­бенности это относится к биополимерам  и полимерам, содержащим низкомолекулярные группы (гаптены), которые иммунологически не активны сами по себе, но приобретают способность индуцировать выработку антител при связывании с полимером-носителам, в первую очередь с белком. Если в качестве гаптенов использовать молекулы низкомоле­кулярных ФАВ, то образующиеся модифицированные ФАВ белки называются конъюгированными антигенами (КА). Они способны индуцировать выработку антител, специфичных к ФАВ, при введении в организм животных, в то время как введение самих ФАВ иммунного ответа не вызывает.

Общий метод синтеза КА заключается в ковалентном при­соединении гаптена к полимеру-носителю. В качестве но­сителя обычно используют белки. Возможно также применение полиаминокислот и полисахаридов, антигенных самих по себе, и других полимеров. Процесс синтеза КА представляет собой ковалентную модификацию белка низкомолекулярным реагентом. Основной принцип получения КА состоит в том, чтобы связать гаптен с белком так, чтобы та часть молекулы гаптена, которая должна служить антигенной детерминантой, осталась свободной. В зависимости от точки связывания гапте­на с носителем можно получить антитела, специфичные к той или иной части его молекулы, а также набор специфических антител. Наличие «вставки» между гаптеном и белком увели­чивает доступность гаптена для распознавания и повышает специфичность вырабатываемых антител.

Лекция 5 - Растворимые полимер - белковые соединения и сшитые белки

Содержание:

Синтез и свойства полимер-белковых коньюгатов и сшитых белков. Коньюгаты белков с полифункциональными полимерами-носителями. Полимер-белковые соединения других типов.

1. Существует несколько стратегических подходов к синтезу водорастворимых полимерных производных белков (рис. 1). Первый подход заключается в ковалентном связывании белка с водорастворимым функциональным полимером. По замыслу эта стратегия аналогична той, которой придерживаются при иммобилизации белков на нерас­творимых носителях, однако переход к растворимым конъюгатам и необходимость последующего их введения в организм вы­зывает дополнительные проблемы.

Рис.1

В то же время рассматриваемый подход относительно прост химически и при удачном использовании обеспечивает реали­зацию полезных свойств полимер-белковых конъюгатов, пере­численных выше.

Для связывания с белком водорастворимый полимер должен иметь группы, способные взаимодействовать с функциональны­ми группами белка в условиях, не вызывающих денатурацию последнего. В подавляющем большинстве случаев это реакции в водных растворах при рН = 6—8, реже 3—10. Химические ме­тоды при этом в основном те же, что применяются при иммо­билизации ферментов, а также для связывания с полиме­ром низкомолекулярных ФАВ. В белке для взаимодействия с полимером-носителем используют главным образом аминогруп­пы. Первый вариант благоприятен для стаби­лизации белка в результате закрепления конформации, но, как указывалось, иногда приводит к значительному изменению фи­зиологической активности. Второй вариант обычно позволяет в большей мере сохранить активность, но в меньшей — сопро­вождается стабилизацией. Полимер-носитель должен быть гидрофилен, чтобы избежать гидрофобных взаимодействий с бел­ком, и содержать функциональные группы, которые могут не­посредственно или после активации реагировать с белком. Свя­зывание белка с полимером протекает по следующей схеме:

Второй подход к синтезу растворимых полимер-белковых конъюгатов также заключается в связывании белка с полиме­ром, но не по боковым функциональным группам, а по одной из концевых. В качестве полимера используют активирован­ные производные моноэфиров полиэтиленгликоля.

Третий подход к синтезу полимер-белковых конъюгатов за­ключается в превращении белка в макромономер в результате введения в него двойных связей, обычно по аминогруппам. Макромономер сополимеризуют с низкомолекулярным гидро­фильным мономером, формируя таким образом оболочку поли­мера-носителя вокруг белковой глобулы.

Четвертый подход к синтезу полимер-белковых конъюгатов также заключается в формировании полимера-носителя вокруг белковой глобулы, однако последняя служит не макромономе­ром, а макроинициатором полимеризации N-карбоксиангидри-дов а-аминокислот.

Полимеризация виниловых мономеров под действием ради­кального инициатора, ковалентно связанного с белком, представляет собой следующий (пятый) подход к синтезу полимер-белковых конъюгатов. В этом случае можно регулировать число и локализацию точек роста цепей.

Полимер-белковые конъюгаты можно получать и на основе нестехиометрических полиэлектролитных комплексов, содержа­щих белок. В отличие от стехиометрических поликомплек­сов нестехиометрические растворимы в воде. Это — шестой под­ход к синтезу полимер-белковых конъюгатов.

2. Трипсин и химотрипсин, связанные с поливинилпирролидоном с М=10 тыс. были получены по следующей схеме:

Свойства растворимых конъюгатов ферментов с полиэлектро­литами зависят от свойств полимера-носителя и самого фер­мента. Это связано с формированием микроокружения бел­ковой глобулы, отличающегося от окружающей среды. Поэтому удачный выбор полиэлектролита позволяет получать стабильные конъюгаты с измененным рН-оптимумом.

Аминогруп­пы трипсина и б-химотрипсина образуют электростатические солевые связи с карбоксильными группами носителя в результате кооперативной реакции. Число связей зависит от плотности заряда на поли­анионе и определяет сдвиг рН-оптимума  и  каталитической константы фермента в реакции гидролиза низкомолекулярного субстрата. Образование солевых связей дестабилизирует белок по отношению к тепловой денатурации. С ростом числа связей лабильность белка увеличивается, а его конформация все бо­лее отличается от нативной.

Свойства ферментов, связанных с полианионными носителя­ми, зависят от характера носителя и условий получения конъю­гата. Белковые конъюгаты на основе синтетических полимеров имеют общий недостаток; пути их метаболизма не ясны, в осо­бенности в отношении входящего в их состав синтетического по­лимера.

Стабилизация белков в полисахаридных конъюгатах вызы­вается несколькими факторами. Один из них за­ключается в сшивании белка, другой был выявлен на примере фиколла-70. О-Метилирование полимера-носителя, т. е. повышение его гидрофобности, приводило к дестабилизации бел­ка в конъюгате, полученном бромциа­новым методом, по отношению к тепловой денатурации. В то же время конъюгаты с самим фиколлом или О-ацетилфи-коллом были стабильнее, чем исходный фермент. При этом все три конъюгата сохраняли примерно в одинаковой мере фермен­тативную активность. Наконец, третий стабилизирующий фактор связан с за­труднением агрегации белковых глобул перед выпадением в осадок в результате наличия гидрофильной полимерной оболочки. Гидратация белка, вероятно, не менее существенна для стабилизации.

3. Понятие «искусственные антигены» обычно связывают с двумя типами макромолекул. К первому относятся белки или природ­ные полисахариды, модифицированные определенными химиче­скими группировками — гаптенами, ко второму — синтетические макромолекулы, которые полностью идентичны природным.  Коллектив взаимо­действующих в иммунном ответе клеток состоит из трех главных классов: В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов и макрофагов. Синтез антител осуществляется В-лимфоцитами, Т-клетки — хелперы — помогают В-клеткам синтезировать антитела к Т-зависимым антигенам. Антигены, вызывающие синтез антител при не­пременном участии Т-лимфоцитов, называют тимусзависимыми или Т-зависимыми. В большинстве случаев кооперация Т - и В-клеток является необходимым условием иммунного ответа. Генетический контроль силы иммунного ответа осуществляется через посредство Т-клеток. Клетки третьего типа — макрофаги или А-клетки, кооперирующиеся с Т - и В-лимфоцитами. Макро­фаги захватывают антигены, попавшие в организм, в резуль­тате чего на поверхности макрофага образуется своеобразная «обойма» антигенных молекул, ориентированных своими детерминантными участками наружу. Эту «обойму» макрофаг пре­доставляет соответствующему В-лимфоциту, поверхностные белковые рецепторы которого связываются с антигенными детер­минантами. Таким путем В-лимфоцит получает первый специфи­ческий сигнал, который необходим ему, чтобы начать размно­жаться и продуцировать антитела. Второй сигнал-—неспецифи­ческий — может исходить от Т-лимфоцита, активированного другим антигеном или митогеном.