Лекарственный фотофорез в восстановительном лечении больных хроническим генерализованным пародонтитом (стр. 2 )

Далее, в эксперименте была изучена зависимость коэффициента поглощения от величины мощности падающего на препарат лазерного излучения в диапазоне мощностей от 5 до 50 мВт в красном и в инфракрасном диапазонах в импульсном режиме. Выявлено, что при пропускании лазерного луча через стандартный слой раствора препарата или гелевой формы раствора препарата (при растворении препарата в электропроводном геле «медиагель» при фотофорезе) в 1 см все характеристики линейны, не имеют отклонений и пропускная способность четко зависит от мощности падающего излучения и концентрации лекарственного вещества. Отмечено отсутствие достоверных отличий в степени прохождения лазерного луча через раствор препарата и его гелевую форму в соотношении 1:1 (толщина 0,2 см) и 2:1 (толщина 0,5 см).

В следующем разделе экспериментального обоснования лазерного фотофореза предприняты исследования спектров пропускания комплекса препаратов с целью разработки рекомендаций по использованию наиболее оптимальных спектральных диапазонов для стимуляции их фармакологического действия. Кроме этого необходимо было показать, что указанные лекарственные препараты, с одной стороны, достаточно хорошо пропускают низкоинтенсивный свет оптического диапазона, что обеспечивает его непосредственное саногенетическое воздействие на ткани пародонта. С другой стороны, это излучение оптического диапазона в некоторой степени поглощается лечебным препаратом, возбуждает его молекулы, усиливает фотоиндуцируемую диффузию и транспорт через мембраны в ткани, что активизирует его фармакологическое действие и саногенетический эффект в целом.

В результате эксперимента по определению коэффициента пропускания образцов препаратов в спектральном диапазоне 200 - 900 нм выявлена следующая динамика, представленная на рисунках 1 (а-е).

а). холисал б). актовегин

в). метрогил дента г). солкосерил

д). троксевазин е). мильгамма (витагамма)

Рис.1 Спектральные характеристики коэффициента пропускания образцов препаратов в диапазоне 200 - 900 нм

Как следует, холисал усиливает пропускаемое излучение за счёт люминесценции в УФ-диапазоне. У актовегина нет ярко выраженного края поглощения - пропускание постепенно спадает в диапазоне нм. Край поглощения для гелей метрогил дента и солкосерила - при 300 нм. У фармпрепарата мильгаммы спектр поглощения существенно отличается от предыдущих: отличное от нуля пропускание появляется при длине волны зондирующего излучения больше 580 нм. Край поглощения для геля троксевазина локализуется в районе нм. Таким образом, пропускание в диапазоне нм для всех мазей находится на уровне 80-90% и спектры препаратов похожи.

На рис. 2 представлены экспериментальные данные о коэффициентах пропускания препаратов в спектральном диапазоне мкм (нм). Интерес к этому диапазону не случаен, т. к. он представляет собой интервал ИК-спектра солнечного излучения, которое может быть использовано в качестве конкурентного по отношению к лазерному излучения для улучшения всасывания лекарственных веществ.

а). б).

Рис. 2 Исследования в спектральном диапазоне нм

а). 1 – кварцевая пустая ампула; 2 – медиагель; 3 – троксевазин; 4 – элькар (л-карнитин);

б). 1 –милдронат; 2 –пантоник; 3 – контрактубекс

Выявлено, что спектры пропускания всех исследованных препаратов имеют две характерные полосы - нм (холисал - 70%, актовегин, метрогил дента -43%, солкосерил - 30%, троксевазин - 26%) и нм (холисал - 32%, актовегин - 7%, метрогил дента - 4%, солкосерил, троксевазин - 20%).

Следовательно, полученные результаты позволяют использовать для активации фармакологических средств не только когерентное лазерное излучение, но и концентрированные потоки некогерентного или солнечного излучения. Кроме того, для препаратов, имеющих аналогичные спектральные характеристики, могут анализироваться возможности их использования для фотофореза.

Представленное экспериментальное исследование позволяет считать, что низкоинтенсивное излучение оптического диапазона, ближней и средней инфракрасной области достаточно хорошо проходит через слои исследованных лекарственных препаратов и частично поглощается ими.

В связи с этим становится очевидной необходимость объективного (прямого, количественного) подтверждения увеличения проникновения исследуемых лекарственных препаратов в ткани слизистой оболочки десны другими методами.

Проведено математическое моделирование явления фотоиндуцированной диффузии используемых лекарственных препаратов, нанесенных на поверхность ткани десны (совместно с сотрудниками Института общей физики (ИОФ) РАН, д. м.н., профессором и к. ф-м н.

В теоретическом плане, можно полагать, что скорость диффузии веществ (Vg) с поверхности ткани десны в ее подлежащие структуры в общем случае зависит от структурно-функциональных параметров самой ткани десны и используемых лекарственных препаратов. Эту зависимость можно охарактеризовать следующей формулой:

Vg = SUT (P/η) (n1-n2)

где S-эффективная площадь поглощающей поверхности десны, U - подвижность молекул веществ (обусловлено наличием колебательной энергии и геометрии молекул), T - температура, P – обратная высота барьера проникновения веществ через ткань, η – вязкость вспомогательной среды, n1- концентрация веществ на поверхности десны, n2 – концентрация лекарственного препарата в ткани.

Величина P=1/(u1-u2), где u1 – потенциал молекул внутри десны и u2 – потенциал молекул снаружи десны, что в итоге и определяет проницаемость мембран для апплицируемого препарата.

Молекулам препарата требуется дополнительная энергия для преодоления потенциального барьера, существующего на границе десна – внешнее пространство, чтобы проникнуть в десну из-за низкой проницаемости мембран тканей. При лазерном облучении поверхности ткани десны в области нанесения фармпрепарата, параметры S и U должны изменять свои значения, так как зависят от I-интенсивности излучения лазера на поверхности десны: Vg=Vg(I), U=U (I), S=S (I).

Для измерения зависимости между величиной интенсивности лазерного излучения и скоростью диффузии молекул лекарственного препарата Vg(I) необходимо измерить концентрацию вещества (n2) в ткани, поскольку n2 пропорционально Vg. При выявлении фототоиндуцированной диффузии на поверхности ткани десны, рядом с областью проведения фотофореза, измеряется интенсивность обратно отраженной волны (I отр.) и интенсивность флюоресценции (I фл.). Также эти величины измеряются в области нанесения препарата, сразу и при мониторинговом режиме наблюдения, что отражается следующей формулой:

I отр. = Iотр.(n2,t), Iфл.= Iфл.(n2,t),

Где Iфл. – интенсивность флюоресценции, Iотр. – интенсивность обратноотраженной волны, t-время, n2- концентрация препарата в ткани десны, n2,t – концентрация через время t. (рис. 3).

Рис.3. Интенсивность флуоресценции на слизистой оболочке десны: в зависимости от времени лазерного облучения и скорости диффузии молекул лекарственного препарата (модель - метрогил дента)

1- необлучаемая область с метрогил дента,

2- облучаемая область с метрогил дента,

3- необлучаемая интактная область.

При нанесении метрогил дента в начале лазерного облучения наблюдается кратковременное увеличение интенсивностей флуоресценции, с третьей минуты отмечается интенсивное гашение флуоресценции за счёт усиленного проникновения лекарственного препарата в ткани при фотофорезе с последующей релаксацией параметров флуоресценции в течение 5 минут, что отсутствует на интактной стороне (рис. 3). Вероятно, данные явления можно объяснить абсорбцией лекарственных субстанций, вытесняющих флуоресцирующие, в том числе, часть белковых молекул межклеточной жидкости из ткани слизистой оболочки десны.

Выявленная закономерность указывает на наличие стимуляции поверхностной диффузии фармвещества и увеличение ее скорости под действием лазерного облучения. Нельзя исключить более медленной фотодиффузии флуоресцирующих частиц белков и других компонентов, окислительного действия синглетного кислорода, окисления флуоресцирующих компонент, или наоборот, получение за счёт химических реакций окисления компонентов, обладающих высокой флуоресценцией.

В результате математического моделирования установлено, что скорость фотоиндуцированной диффузии может быть выше на 50%, чем в случае аппликации лекарственного препарата без лазерного облучения.

Таким образом, проведение лекарственного фотофореза позволяет увеличить скорость проникновения лекарственных препаратов через слизистую оболочку десны.

В эксперименте на кроликах подтверждена количественная оценка проникновения исследуемых лекарственных препаратов в ткани пародонта под воздействием лазерного излучения при фотофорезе (совместно со ст. н.с. лаборатории молекулярной биохимии НЦПЗ РАМН к. х.н. В), методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе “Beckman Coulter” (США).

Эффективность лекарственного фотофореза оценивали по количественному определению при помощи ВЭЖХ содержания субстанций препарата на поверхности десны кроликов в экспериментах, первом (c облучением) и во втором (без облучения), определяли процентное отношение эффективности проникновения лекарственного препарата в экспериментах при сравнении результата с облучением и без облучения при 254 нм. Для проведения определения относительного всасывания лекарственной субстанции мази в % (A), на хроматограммах измеряли площади, соответствующие поглощению пиков субстанций определяемых веществ без лазерного воздействия (S) и с лазерным воздействием (Sl), а так же площади на хроматограммах слабопроходящего через слизистую оболочку десны бензоилбензоата (медиагеля) (Sb или Sb1) в соответствующем эксперименте, который использовали в качестве внешнего стандарта для проведения расчетов. Определение проводили по формуле:

A = 100% х ( 1 – Sl/Sbl : S/Sb) .

В качестве стандарта, использовали препараты бензилбензоат или медиагель и другие мази, содержащие субстанции лекарственных средств, поглощающие при 254 нм, с вспомогательными веществами, не поглощающими при данной длине волны и не препятствующими хроматографическому определению.

В качестве препаратов, содержащих лекарственные вещества, использовали гели троксевазин и метрогил дента. Определение концентраций при высокоэффективной жидкостной хроматографии проводилось по поглощению при 254 нм по отношению концентрации определяемой и по площадям пиков лекарственных веществ к концентрации бензоилбензоата (медиагеля), который добавлялся в исследуемый препарат в качестве внутреннего стандарта для проведения измерений.

Проведение анализов с гелями актовегин и солкосерил отличалось по процедуре анализа из-за недостаточного поглощения и недостаточной чувствительности определения фармвеществ при 220 и 254 нм. Для определения, входящих в состав препаратов слабопоглощающих в УФ - области пептидов, лекарственных веществ и примесей, имеющих в своем составе свободные аминогруппы, для актовегина или солкосерила использовали получение N-дансильных производных. Процедура получения N-дансильных производных была стандартной, с использованием дансилхлорида в ацетоне, ацетона в качестве растворителя для композиций мазей, и отличалась тем, что в качестве основания использовался N-метилморфолин в виде 10% раствора в ацетоне.

Время воздействия лазерным излучением в красном и ИК-диапазоне, мощностью до 50мВт в постоянном и импульсном режиме при лекарственном фотофорезе на ткани десны кроликов в обоих случаях было одинаковым и составляло 2 мин при периодическом модулированном облучении с частотой 20 Гц контактно. Периодическое модулированное облучение позволило добиваться всасываемости лекарственных препаратов при более щадящем лазерном воздействии.

Для препаратов троксевазин, метрогил дента, актовегин, солкосерил подтверждено всасывание в ткань десны компонентов и возможность применения их при фотофорезе в индивидуальном виде и в виде композиций.

Количественное содержание субстанций в препаратах до и после облучения лазером на слизистой оболочке десны, определяли по их поглощению при 254 нм при ВЭЖХ по отношению к бензилбензоату (медиагелю), который использовали в качестве стандарта. Затем рассчитывали отношение концентраций субстанции мази определенной при высокоэффективной жидкостной хромотографии (ВЭЖХ) по поглощению при 254 нм по отношению к концентрации определенного бензилбензоата, эти данные приведены в таблице 2 (фрагмент исследований по гелю троксевазин).

В результате проведенного исследования было установлено, что всасывание фармвещества троксевазина (троксерутин) значительно увеличивается под действии лазерного облучения на десну кролика по сравнению с аппликацией без облучения до 80 % и при сравнении постоянного и импульсного режимов лазерного излучения, в импульсном режиме может составлять до 60% в течение 2 минут.

Таким образом, при сравнения данных поз. 2 и 15 (таб. 2) можно сделать вывод о преимуществах импульсного режима воздействия лазерного облучения, поскольку при меньшей дозе лазерного облучения обеспечивается высокое значение биопроницаемости и через слизистую оболочку десны проходит около 60% фармвещества геля троксевазин за 2 мин.

Таблица № 2.

Количественное содержание субстанций в препаратах до и после облучения лазером на слизистой оболочке десны кроликов (фрагмент исследования - гель троксевазин).

№ поз.	Лазерное облучение	Наименование смеси, мазей	Детектируемые вещества, мази	Время удер-живания веществ при ВЭЖХ	Содер-жание % в пробе	Отношение % содер. субстанции к бензилбензоату в опыте	Относи-тельное всасы-вание субстан-ции в %
нет	да
1	2	3	4	5	6	7	8	9
1. Эксперименты на десне кролика с нанесением мази и лазерным облучением.
1	нет		бензилбензоат	бензилбензоат	8,167	94,22	1
2		да	троксе-вазин	троксерутин	6,867	2	0,573	88,5
			бензилбензоат	бензилбензоат	8,433	3,49
3	нет		троксе-вазин	троксерутин	6,717	2,45	5
			бензилбензоат	бензилбензоат	8,667	0,49
3.1.Контрольные эксперименты на десне кролика при импульсном лазерном облучении.
14	нет		троксе-вазин	троксерутин	6,483	82,29	4,74	7,2
	(исход-ная		бензилбензоат	бензилбензоат	8,333	17,34
	смесь на
	десне 2 (мин)
15		да	троксе-вазин	троксерутин	6,5	56,28	1,98	58,2
		имп.	бензилбензоат	бензилбензоат	8,35	28,42

Следовательно, биопроницаемость и биодоступность лекарственных препаратов может увеличиваться при лекарственном фотофорезе. За счет увеличения общего количества капилляров при фотофорезе, лекарственные вещества попадают даже в те части десны, где микроциркуляция в обычных условиях затруднена, т. е. в застойных зонах и эффективность лечения повышается. Увеличение степени биопроницаемости и биодоступности зависит от растворимости лекарственных субстанций в водной фазе, химической структуры и физико-химических свойств лекарственных субстанций, условий облучения лазером. Нами было показано, что малорастворимые ароматические вещества, например, как бензилбензоат, метилпарагидроксибензоат – практически не всасываются при фотофорезе, а ряд лекарственных субстанций, например, метронидазол и троксерутин, растворимые пептидные вещества - всасываются в значительной степени под действием фотофореза.