Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и особенности проявления болезни в современных условиях ведения (стр. 2 )

2.2.1.2. Оптимизация параметров культивирования вируса в

чувствительных клеточных системах

Изучение оптимальных условий культивирования вируса проводили по следующим параметрам: метод (стационарный и роллерный), температура культивирования в атмосфере 5% СО2 при 33-37°С; возраст культуры клеток (2-7 суток); время адсорбции вируссодержащей суспензии (I- 1,5 – 2 ч), множественность заражения (0,0001-0,1 ТЦД50/клетка), рН питательной среды (6,0-7,8); вид сыворотки в поддерживающей среде (крупного рогатого скота, телят, эмбриона коровы, северных оленей, цыплят) и ее процентное содержание (2, 5 и 10%%).

В результате опытов изучили динамику накопления вируса, а также влияние некоторых биологических и химических веществ (ДЭ, ФГА, трипсин, ДМС0, ДЭАЭ-декстран) на титр вируса при культивировании. Была проведена адаптация штамма к чувствительным культурам клеток.

В результате серии опытов установили, что оптимальными условиями для накопления штамма РС-Б вируса являлись: использование 3-5 суточной культуры клеток ЛЭК и Л5Э и 3-х суточной FLK с предварительным 3-х кратным отмыванием монослоя от ростовой среды, в состав которой входит коммерческая сыворотка крови крупного рогатого скота или телят (10%),

Оптимальными условиями культивирования штамма К-18 были: использование 2-3 суточных культур клеток ТЭБ и ТБ с предварительным 3-х кратным отмыванием монослоя клеток от ростовой среды. При использовании сыворотки эмбриона коровы производства фирмы «Hyclone» необходимость отмывания монослоя клеток отпадала.

В процессе адаптации штаммов вируса к различным культурам клеток установили, что в 30 сериях коммерческих сывороток взрослого крупного рогатого скота и телят, используемых для культивирования культур клеток, присутствовали антитела к вирусу в титрах 4 – 7 lg2, отрицательно влияющие на сроки появления и характер ЦПД вируса и его репродукцию.

Множественность заражения составила 0,1 ТЦЦ50/клетка; время адсорбции 1,5 ч с использованием питательной среды Игла MEM, Игла и RPMI - 1640 (2:1) с добавлением 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, сыворотки северных оленей или сыворотки цыплят при рН 7,4-7,8 с последующим инкубированием в стационарных или роллерных условиях при температуре 37°С.

При данном режиме культивирования максимальное накопление вируса происходило на 6 сутки культивирования в ЛЭК и на 5 сутки в Л5Э и FLK, а для штамма К-18 – в ТЭБ. Добавление ДЭАЭ-декстрана 50 мкг на 1 мл и ДМСО в 1%-ной концентрации повышало инфекционную активность вируса на 0,84 lg ТЦЦ50/мл и 0,52 lg ТЦЦ50/мл, соответственно.

В результате адаптации штамма к Л5Э и П5Э к 20-му пассажу титр вируса составлял 4,96±0,03 и 4,95±0,05 lg ТЦЦ50/мл, соответственно. С помощью перемежающихся пассажей (1:2) из указанных диплоидных культур клеток провели адаптацию вируса к культурам клеток ЛЭК и FLK, в которых титр вируса к 10 пассажу достигал 4,82±0,07 и 4,83± 0,04 lg ТЦД50/мл, соответственно. Дальнейшее пассирование вируса в этих культурах клеток не привело к повышению его инфекционной активности.

2.2.2. Эффективность различных методов индикации вируса

в инфицированных культурах клеток

В связи с тем, что размножение вируса в культурах клеток не всегда сопровождается развитием видимого цитопатического действия (ЦПД), для его ранней индикации в них использовали методы бляшкообразования (БОЕ), окрашенных фокусов (ФОЕ), цитоморфологические исследования (окраска инфицированных культур клеток 0,5%-ным раствором амидового черного на 0,5% - ной уксусной кислоте и выявление синцитиев в окрашенных по Романовскому-Гимза препаратах инфицированных клеток при помощи световой микроскопии), а также ОТ-ПЦР.

Учет результатов проводили в течение 7 суток культивирования вируса. Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Сравнительная эффективность различных методов индикации вируса в инфицированных культурах клеток

Вид культуры клеток	Метод индикации вируса	Сроки выявления вируса, (сутки)	Возможность количественного определения инфекционной активности вируса	Специфичность метода, (+; -)
FLK, ТЭБ	БОЕ	3-7	+	+
ФОЕ	3-7	±	±
Цитоморфологический	2-7	-	±
ОТ-ПЦР	1-7	+	+

Из данных таблицы 2 видно, что наиболее точным методом титрования явился метод бляшек. Однако он более трудоемок, требует тщательного подбора ингредиентов и определенного навыка в постановке.

Фокусы цитопатического действия вируса в культуре клеток, различаемые микроскопически как скопления клеток, образовывались на 3-4 сутки после ее заражения и были видимыми на 5-8 день. Однако если деструкция в центре фокусов была слабо выражена, их учет без предварительной окраски затруднялся. Поэтому для выявления фокусов визуально необходимо дополнительно использовать окраску инфицированных клеточных культур 0,5%-ным раствором амидового черного на 0,5% - ной уксусной кислоте.

В фиксированных и окрашенных клеточных культурах фокусы ЦПД вируса были отчетливо видны и визуально. Окраска их не изменялась при длительном хранении, что значительно облегчало учет и анализ полученных результатов.

Далее необходимо было установить продолжительность инкубации вируса при окраске инфицированных культур для визуального учета фокусов. При окрашивании клеточных культур через 3-4 суток после заражения вирусом, различать и подсчитывать фокусы визуально было трудно. Окрашивание инфицированной культуры клеток FLK на 5-6 сутки инкубирования приводило к увеличению размеров фокусов и возможности их визуального подсчета, а на 7-8 сутки приводило к увеличению размеров фокусов, но и образованию вторичных фокусов или слиянию первичных. Поэтому окраску зараженных культур клеток проводили на 5-6 сутки инкубирования. Кроме того, указанный срок был признан оптимальным для накопления вируса, что было установлено в предыдущих исследованиях.

Результаты сравнительного определения инфекционной активности вируса штамма РС-Б в культуре клеток FLK представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Сравнительное титрование штамма РС-Б респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток FLK (n=3)

Методы титрования	Инфекционность вируса
M ± m	Р
Титрование в пробирочной монослойной культуре клеток Титрование по ФОЕ в 50 мл флаконах	3,96± 0,02 lg ТЦД 50/мл 4,40± 0,06 х 104,0 ФОЕ/ мл	< 0,001 < 0,001

В результате метод титрования по ФОЕ оказался несколько чувствительнее метода титрования по ЦПД в пробирках и простым в учете. Наиболее эффективными методами контроля репродукции вируса в инфицированных культурах клеток оказались ОТ-ПЦР и методы титрования по БОЕ и ФОЕ, однако результаты ОТ-ПЦР были положительными в более ранние сроки.

При электронной микроскопии проб культурального, концентрированного и очищенного вирусов обнаруживали характерные для PC-вируса вирионы, морфологически представляющие собой округлые или полиморфные частицы (80-160 Нм), наружная мембрана которых покрыта отростками.

Изучение морфологических изменений в зараженных культурах клеток FLK и ТЭБ проводили также на примере двух штаммов вируса – РС-Б и К-18. Размножение вируса сопровождалось образованием цитоплазматических включений, а также синцитиев различного размера, содержащих от 5 до 10 ядер. Цитоморфологический метод позволял выявлять вирус в культуре клеток в затруднительных случаях учета ЦПД световым микроскопированием, обнаруживать его в клетках на ранних стадиях репродукции, а также подтверждать специфичность цитопатогенного действия, однако по срокам постановки и специфичности уступал ОТ-ПЦР.

2.2.3. Параметры хранения вируссодержащей суспензии в

лабораторных условиях

Учитывая высокую чувствительность вируса к замораживанию и оттаиванию, изучали сроки его сохранности при различных температурных режимах. Результаты показали, что хранение культуральной вируссодержащей жидкости при температуре 4°С снижает инфекционную активность вируса на 3,0 lg в течение 2 месяцев, при минус 25°С на 3,5 lg - в течение 6 месяцев, при минус 70° на 2,5 lg в течение 7 месяцев. Хранение лиофилизированного вируса при минус 25°С в течение 12 месяцев снижало его титр на 1 lg ТЦД50/мл. Таким образом, оптимальными условиями хранения лиофилизированного вируса (штаммы РС-Б и К-18) являлись температура минус 25°С, а нативного – минус 70°С.

Хранение вируссодержащих суспензий, полученных из проб внутренних органов животных, при минус 18°С обеспечивало сохранность материала из слизистой оболочки трахеи в течение двух месяцев, носовых выделений и бронхов – 4-х месяцев, бронхиального экссудата – 6-ти месяцев, а легких – 12 месяцев. Оптимальным режимом хранения выделенной РНК вируса являлся минус 18оС в течение 2-10 месяцев, в зависимости от вида исследуемого материала. Наиболее пригодным материалом для исследований в ОТ-ПЦР являлись пробы легких, бронхиального экссудата и бронхов.

2.2.4. Разработка эритроцитарного диагностикума для серологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного

рогатого скота, овец и коз методом РНГА

При разработке специфического эритроцитарного антигена для серологической диагностики болезни использовали методы Денера и Martin в авторской модификации. Технология изготовления антигена изложена в НТД на «Набор для серодиагностики респираторно-синцитиальной инфекции (РС-инфекции) крупного рогатого скота, овец и коз» (ТУ91). Данные по сравнительной активности эритроцитарных антигенов представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Сравнительная активность эритроцитарных антигенов, полученных при репродукции штамма РС-Б РСВ КРС в различных культурах клеток (n = 3)

№ п/п	Культура клеток	Титр вируса, lg ТЦД50/мл М ±m; Р<0,05	Количество серий	Активность антигена со специфической сывороткой к РСВ в титрах, lg2, М ±m; Р<0,05
1	МDВК	1,65±0,10	12	4,5±0,25
2	ДЛЭК	2,14±0,21	2	5,5±0,25
3	ЭЛЭК	2,17±0,46	3	5,67±0,24
4	ТБ	3,04±0,04	2	6,5±0,25
5	ПЭК	3,20±0,15	3	6,67±0,24
6	Т-1	3,78±0,11	29	7,52±0,12
7	46/47	3,64±0,11	2	6,5±0,25
8	ЛЭК	4,75±0,14	19	7,73±0,11
9	FLK	4,76±0,13	18	8,55±0,09
10	П5Э	4,95±0,05	7	9,36±0,12
11	Л5Э	4,96±0,03	16	9,69±0,14
12	ПТ	3,74±0,11	13	7,38±0,09
Всего серий	126

Из данных таблицы 4 следует, что активность эритроцитарных антигенов зависела от титра вируса, который использовали для их получения. По мере повышения титра вируса повышался и титр антигена, что было связано с видом культуры клеток, в которой размножали вирус. Так, в культуре клеток 46/47 титр вируса составил 3,64±0,11 lg ТЦД 50/мл, а титр эритроцитарного антигена 6,5±0,25. В культуре клеток ЛЭК титр вируса составил 4,75±0,14 lg ТЦД 50/мл, в FLК – 4,76±0,13 lg ТЦД 50/мл, П5Э –4,95±0,05 lg ТЦД 50/мл, Л5Э –4,96±0,03 lg ТЦД 50/мл, а активность антигена в разведениях - 7,73±0,11; 8,55±0,09; 9,36±0,12 и 9,69±0,14 lg2, соответственно.

После адаптации штамма к перевиваемым линиям культур клеток Т-1 и ПТ его титр достигал 3,78±0,11 lg ТЦД 50/мл и 3,74±0,11 lg ТЦД 50/мл, а активность эритроцитарного антигена 7,52±0,12 и 7,38±0,09 lg2.

Таким образом, было показано, что наиболее пригодными для репродукции штамма РС-Б с целью получения эритроцитарного антигена оказались диплоидные клетки легких и почки эмбриона коровы, несколько уступали им перевиваемая линия почки эмбриона овцы и первичная культура легкого эмбриона коровы и перевиваемые линии почка теленка (Т-1) и почка теленка (ПТ).

Из вируссодержащей суспензии, полученной в этих культурах клеток, готовили наиболее активные эритроцитарные антигены, титры которых со специфической к PC-вирусу сывороткой составляли от 7,92±0,22 до 10,15±0,09 lg2.

Совместно с изготовили 126 серий эритроцитарного антигена, из них 96 использовали для выявления антител к вирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота, овец и коз в РНГА. Полученные антигены сохраняли активность в течение 12 месяцев со дня приготовления при хранении в сухом месте и температуре 2-10°С.

С целью получения положительного контроля в РНГА получали специфические гипериммунные сыворотки к штамму РС-Б РСВ КРС с использованием мышей, морских свинок, баранов и кроликов. Результаты, опытов показали, что штамм РС-Б РС-вируса крупного рогатого скота не обладает выраженной антигенной активностью для белых мышей и морских свинок при использованном способе иммунизации. На его введение у животных синтезировались вируснейтрализующие антитела в титре 2,22 ±0,11 lg2. Для иммунизации баранов и кроликов использовали концентрированный препарат РСВ КРС с адьювантом Фрейнда, на который получили сыворотки крови с титром в РН у баранов 6,08±0,09 lg2, у кроликов 5,38±0,16 lg2, которые и использовали в дальнейшей работе.

2.2.5. Распространение РСИ КРС в хозяйствах Российской Федерации

по результатам серологических исследований

Исследованию подвергли 3623 пробы сыворотки крови от крупного рогатого скота различных половозрастных групп из 16 регионов Российской Федерации. Результаты показали, что РСИ КРС широко распространена во всех обследованных областях и краях Российской Федерации. Наибольшее распространение она получила в регионе,9%),,2%), 7 (87,2%) и 9 (86,6%),,3%),,2%). В других регионах инфицированность животных находилась в пределах 52,6% - 81,8%. Наименьшее количество положительных проб выявляли от животных из регионов 1 и 2: 34,7% и 15,1%, соответственно.

Нами не установлено различий в географическом распространении болезни среди крупного рогатого скота различных возрастов. Наибольшее количество серопозитивных к вирусу животных выявили в крупных молочных хозяйствах с высокой концентрацией и молочной продуктивностью коров, куда вводились новые животные. Инфицированность крупного рогатого скота в средних и мелких хозяйствах была ниже, однако при повышении молочной продуктивности она возрастала, а вместе с ней – риск возникновения респираторных болезней, протекающих с участием данного вируса. Большое значение имела плотность животных на единицу площади, а также ввод вирусоносителей в стадо.

Антитела к вирусу чаще выявляли у молодняка крупного рогатого скота в возрасте: 4-6 месяцев (71,9%); 2-4 месяца (69,2%); 6-9 месяцев (55,9%); взрослых животных (50,8%) и до 1,5 месяцев (36,8%).

При ретроспективных исследованиях сероконверсию к вирусу, свидетельствующую о его роли в развитии респираторной патологии, выявляли у телят в возрасте: 4-6 месяцев в 52,6% случаев; 7-9 месяцев в 50,0%; 3-4 месяца в 37,5%; 6-8 месяцев – 25,0%; 2-3 месяца – 6,7%; 1 месяц – 4,0% случаев.

Таблица 5 – Результаты серологических исследований крупного рогатого скота на респираторно-синцитиальную инфекцию в различных регионах РФ

Регион	Исследовано проб всего	Выявлено положительных
всего	% от числа исследованных
1	533	185	34,71
2	378	57	15,08
3	165	135	81,82
4	57	30	52,63
5	233	130	55,79
6	32	25	78,13
7	179	156	87,15
8	139	108	77,70
9	575	498	86,61
10	196	163	83,16
11	215	179	83,26
12	237	225	94,94
13	44	41	93,18
14	239	140	58,58
15	351	191	54,42
16	50	40	80,00
Всего	3623	2303	63,57

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что наиболее восприимчивыми к заболеванию респираторно-синцитиальной инфекцией являются телята в возрасте от одного до 6-месячного возраста. В некоторых случаях болезнь может проявляться и у животных старших возрастов.