Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и особенности проявления болезни в современных условиях ведения (стр. 1 )

животноводства

На правах рукописи

СТРОГАНОВА

ИРИНА ЯКОВЛЕВНА

ДИАГНОСТИКА РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ БОЛЕЗНИ В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ ВЕДЕНИЯ

ЖИВОТНОВОДСТВА

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Новосибирск – 2011

Работа выполнена в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и в Институте прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

,

доктор ветеринарных наук, профессор

,

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: ГНУ Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный институт Россельхозакадемии

Защита состоится «29» ноября 2011 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01. при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «___» ________ 2011 г.

 

Ученый секретарь

диссертационного совета

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в России возрастает удельный вес хозяйств по производству молока. В некоторые из них осуществляется ввоз высокопродуктивного скота из других стран. Высокая молочная продуктивность коров часто сопровождается нарушением обмена веществ, что приводит, в частности, к активизации различных инфекционных агентов ( и соавт., 2000; , 2006). Существуют также молочно-товарные фермы, в которых концентрация животных и их продуктивность бывают разными, а ввод новых животных ограничен. Учитывая существование различных по направлению, численности, концентрации и продуктивности животных хозяйств, эпизоотическая ситуация в них по инфекционным болезням может различаться.

Широкое распространение в молочных хозяйствах получили респираторные болезни животных ( и соавт., 2002; и соавт., 2003; , 2006; и соавт., 2007; J. Kampa et al., 2009; K. A. Woodbine, 2009; J. F. Ridpath, 2010).

Эти болезни, как правило, протекают с участием нескольких возбудителей, синергетическое взаимодействие которых приводит к усилению тяжести инфекционного процесса ( и соавт., 1984; и соавт., 2000; , 2002; и соавт., 2008; , 2009; D. G. Bryson, 2000; K. A. Brogden et al., 2002).

Одним из этиологических агентов данной патологии является респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), относящийся к семейству Paramyxoviridae, роду Pneumovirus. Во многих зарубежных странах его относят к числу наиболее важных патогенов молочного скота (L. E. Larsen, 2000; S. Hagglund, 2005; C. Luzzago et al., 2010; B. W. Brodersen, 2010).

Первые сообщения о РСИ КРС в нашей стране относятся к 1975 году ( и соавт., 1975). Изучению болезни и разработке средств и методов диагностики были посвящены работы (1976),
(1983), (2004), (2008) и других.

Несмотря на относительно высокую степень изученности многих вирусных болезней, в нашей стране данных, касающихся роли этого возбудителя в возникновении респираторных болезней, в том числе в ассоциациях с другими вирусами, недостаточно. Изучение этой инфекции длительное время сдерживалось из-за высокой лабильности вируса и слабой его способности к размножению в культурах клеток, что, в свою очередь препятствовало разработке диагностических препаратов. Поэтому многие вопросы, касающиеся диагностики, особенностей эпизоотической ситуации, возрастной восприимчивости животных к инфицированию вирусом, характера проявления болезни в молочных хозяйствах в зависимости от их специализации и уровня молочной продуктивности коров остаются открытыми.

Цель и задачи исследований. В связи с этим целью работы являлась разработка эффективных способов серологической и вирусологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и изучение их роли при комплексной оценке особенностей проявления болезни в современных условиях ведения молочного животноводства, в том числе в аспекте смешанных инфекций, протекающих с участием других вирусов и условно-патогенных бактерий.

Для достижения указанной цели были поставлены задачи:

1. Определить и отработать оптимальные параметры выделения, типирования и культивирования РСВ КРС в различных культурах клеток с целью получения антигена, а также – изготовить и испытать эффективность экспериментальных серий эритроцитарного диагностикума в РНГА для выявления антител к вирусу.

2. Изучить пригодность ОТ-ПЦР для типирования вируса в лабораторных условиях, определить ее значение в диагностике болезни у крупного рогатого скота, выяснении роли вируса в этиологии массовых респираторных болезней, а также выявлении наиболее восприимчивых половозрастных групп животных в молочных хозяйствах различного профиля, с учетом наличия импортного и местного скота.

3. С использованием серологического и молекулярного методов исследований провести комплексный анализ особенностей проявления респираторно-синцитиальной инфекции в современных условиях при различных эпизоотических и хозяйственных ситуациях, в том числе в ассоциации с другими вирусными и бактериальными агентами.

Научная новизна. Выделен штамм вируса К-18, депонированный в коллекции микроорганизмов ФГУ ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под наименованием «Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота К-18, V-406». Подана заявка на получение патента на изобретение РФ № № от 01.01.2001 г. «Метод первичной изоляции штаммов вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, штамм вируса Bovine Respiratory Syncitial Virus для изготовления диагностических препаратов».

Новизной обладают данные по изучению чувствительности первично-трипсинизированных и перевиваемых (гомологичных и гетерологичных) линий культур клеток к РСВ КРС. Подобраны и рекомендованы для практического использования наиболее чувствитель­ные культуры клеток. Определены оптимальные условия культивирования, обеспечивающие максимальное накопление вируса. Показана чувствительность к вирусу новой перевиваемой линии культуры клеток ТЭБ, рекомендованной для его выделения из проб биоматериала от животных.

Отработаны методы ранней индикации, контроля размножения и учета инфекционной активности вируса в чувствительных культурах клеток. В том числе показано преимущество ОТ-ПЦР перед традиционными методиками выявления и титрования вируса: цитопатогенное действие (ЦПД); методы бляшкообразующих единиц (БОЕ) и фокусообразующих единиц (ФОЕ); цитоморфологические исследования и электронная микроскопия. Установлены сроки хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах. Изучена возможность дальнейшего использования штаммов вируса PC-Б и К-18 для изготовления эритроцитарного диагностикума. Показано, что чувствительность культур клеток к вирусу имеет «штаммовую» зависимость. Разработан лабораторный рег­ламент культивирования вируса с целью из­готовления специфического эритроцитарного антигена для серологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупно­го рогатого скота, овец и коз в РНГА.

С помощью серологических и молекулярных методов исследований показано широкое распространение РСИ КРС в Российской Федерации, а также в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства. При помощи ОТ-ПЦР выявлены наиболее восприимчивые к инфицированию вирусом половозрастные группы животных. Выявлены особенности эпизоотической ситуации по РСИ КРС, а также смешанным вирусно-бактериальным болезням в условиях промышленного молочного животноводства Сибири с наличием или отсутствием импортированного скота. Изучена частота проявления болезни в зависимости от наличия сопутствующих вирусных инфекций (инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея, аденовирусная инфекция и других), а также от некоторых эпизоотологических и хозяйственных факторов. Впервые показана зависимость частоты инцидентности болезни в крупных молочных хозяйствах от уровня серопозитивности и наличия животных, персистентно инфицированных вирусом ВД-БС КРС. Выявлены и изучены ассоциации вирусов и бактерий, возникающие при вспышках массовых респираторных болезней, протекающих у крупного рогатого скота с участием РСВ КРС. Изучена частота выявления вируса в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellacceae.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты создают перспективы использования серологического и вирусологического методов диагностики РСИ КРС в производственных условиях с целью объективной комплексной оценки эпизоотической ситуации и для оптимизации противоэпизоотических мероприятий в хозяйствах с интенсивным типом ведения животноводства, в том числе решении вопроса о специфической профилактике болезни.

Кроме того, они расширяют научные знания относительно спектра чувствительных культур клеток к РСВ КРС, биологических свойств и роли вируса в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота на крупных молочных комплексах. Комплекс диагностических методов исследований может использоваться также при дальнейшем изучении эпизоотической ситуации, патогенеза РСИ КРС и смешанных вирусных и вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетическому типу.

Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке научно-методических рекомендаций и положений:

- «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол от 26 января 2010 г.).

- «Вирусные и вирусно-бактериальные респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота», утвержденных научно-техническим советом Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Красноярский государственный аграрный университет" (протокол от 14 декабря 2010 г.).

- «Стратегия общих и специальных мероприятий при респираторных болезнях молодняка крупного рогатого скота вирусно-бактериальной природы», утвержденных научно-техническим советом Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Красноярский государственный аграрный университет" (протокол № 2 от 01.01.01 г.).

- «Методы молекулярной биологии и их использование в диагностике вирусных болезней крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол от 11 февраля 2011 г.).

- «Индикация и идентификация респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культурах клеток», утвержденных подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол от 11 февраля 2011 г.).

- «Профилактика и лечение вирусных респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота", утвержденных научно-техническим советом Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Красноярский государственный аграрный университет" (протокол от 20 апреля 2011 г.).

Основные положения диссертационной работы использованы при разработке научно-технической документации на:

1. Тест-систему для серологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, овец и коз в РНГА (ТУ91).

2. Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499).

Апробация работы. Основные положения диссертации были доло­жены на: Всесоюзной научно-практической конференции «Интенсификация сельскохозяйственного производства в условиях радикальной экономической реформы», Сумы, 1989; Научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Наука – сельскохозяйственному производству», Красноярск, 1993; Научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Наука – сельскохозяйственному производству», Красноярск, 1995; ХI Международном симпозиуме «Реконструкция гомеостаза», Красноярск, 1998; «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения животноводства Сибири», Новосибирск, 2006; Международной школе – конференции «Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири», Красноярск, 2008; Всероссийской научно-практической конференции ФГОУ ВПО КрасГАУ «Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития», Красноярск, 2009; Межрегионарной научно-практической конференции «Аграрно-экономическая наука республики Тыва: основные результаты и перспективы», Кызыл, 2009; Международной конференции «Проблемы современной аграрной науки» ФГОУ ВПО КрасГАУ, Красноярск, 2009; Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 40-летию ВНИТИБП, Московская область, Щелковский район, поселок Биокомбината, ВНИТИБП, 2009; Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития», Саратов, 2010; Международной научно-практической конференции «Современные научно-практические достижения в ветеринарии», Киров, 2010; IV Международной конференции молодых ученых «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», Новосибирская область, п. Краснообск, 2010; Всероссийской очно-заочной научно-практической конференции «Инновация в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития», Красноярск, 2010; Международной научно-практической конференции «Научные основы улучшения ветеринарного благополучия и продуктивности сельскохозяйственных животных», Кызыл, 2010; XIII Международной научно-практической конференции «Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана», Улаанбаатар, 2010; Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экономического развития и обеспечения безопасности в области ветеринарии», Троицк, 2010; Международной заочно научной конференции «Проблемы современной аграрной науки», Красноярск, 2010; Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня основания Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока «Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири», Новосибирская область, п. Краснообск, 2010; VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010», Москва, 2010.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 47 научных работ, в том числе 20 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации («Ветеринария», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Вестник КрасГАУ», «Достижения науки и техники АПК», «Аграрный вестник Урала», «Сельскохозяйственная биология»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 330 страницах машинописного текста и состоит из введения, об­зора литературы, собственных исследований, обсуждения получен­ных результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 33 рисунками. Список литературы включает 486 источников, из них 135 отечественных и 351 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Результаты разработки и изучения эффективности серологического и молекулярного методов диагностики РСИ КРС в экспериментальных и производственных условиях;

2. Эффективность усовершенствованных методов диагностики РСИ КРС при комплексной оценке особенностей проявления болезни в различных эпизоотических и хозяйственных условиях, в том числе в ассоциациях с другими вирусами и условно-патогенными бактериями в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства с наличием импортного скота и без него.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии-диагностический центр ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и на кафедре эпизоотологии и паразитологии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» в  гг. Отдельные разделы диссертации выполнены совместно с сотрудниками проблемной лаборатории ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО Московской академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. .

Вирус. В опытах использовали штаммы РС-Б, полученный из БелНИИЭВ им. , и К-18, выделенный и охарактеризованный нами.

Культуры клеток. Для выделения, адаптации и крупномасштабного культивирования вируса использовали 18 культур клеток различного происхождения. В качестве ростовой использовали питательную среду Игла МЕМ с однократным набором аминокислот и витаминов, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл канамицина. Клетки культивировали при 370С в условиях 5% СО2. В качестве ростового фактора добавляли 5-10% эмбриональной сыворотки крови (HyClone, лот №ASA28574), тестированной на наличие вируса ВД-БС КРС и антител к нему. В качестве поддерживающей использовали ту же среду с 2% сыворотки.

При выращивании культур клеток и для культивирования вируса использовали 0,25% раствор трипсина, 0,01% раствор химопсина в 0,02% растворе Версена, диметилсульфоксид (ДМСО), ДЭАЭ – декстран, дрожжевой экстракт (ДЭ), фитогемагглютинин (ФГА), коммерческий 7,5% раствор бикарбоната натрия.

Реакцию нейтрализации проводили микрометодом с использованием наиболее чувствительных культур клеток. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в чувствительной культуре клеток по ЦПД: в пробирочных культурах клеток и микрометодом; титр рассчитывали по методу Reed и Muencn (1938) и выражали в ТЦД50/мл. Использовали также методы бляшек (БОЕ) по (1988) и окрашенных фокусов по Calnek В. et al. (1972); титр выражали в БОЕ/мл и ФОЕ/мл.

Электронная микроскопия. Образцы культурального и концентрированного очищенного вируса просматривали на электронном микроскопе JEM-100 CX-II совместно со ст. науч. сотр., канд. биол. наук ФГУ ВГНКИ ветпрепаратов Россельхознадзора Препараты готовили по методу негативного контрастирования с применением 2%-ного водного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,0).

Препараты для цитоморфологического исследования готовили из пробирочных культур клеток целлоидиновым методом и окрашивали гематоксилин-эозином по методу , (1971).

Эритроцитарный диагностикум готовили по методу Л. Денер. и др. (1976), Н. Martin (1983) в нашей модификации. Полученные препараты использовали для серодиагностики РСИ КРС, овец и коз в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Для получения гипериммунных сывороток к РСВ КРС использовали белых мышей линии BALB/C массой 20-30 г и морских свинок массой 300-350 г. Гипериммунизацию животных проводили путем введения культуральной вируссодержащей суспензии, а также концентрированного и очищенного по методу Trudel M. (1986) вируса интраназально с учетом схемы, предложенной и (1976). Дополнительно использовали баранов и кроликов.

Вирусологические и молекулярные исследования. При изучении распространения РСИ КРС использовали результаты собственных исследований. Дополнительно анализу были подвергнуты результаты серологических, вирусологических и бактериологические исследований, проведенных в ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория (ЦНМВЛ), ГУ Тюменская областная ветеринарная лаборатория, ФГУ Новосибирская межобластная ветеринарная лаборатория, КГУ Алтайская ветеринарная лаборатория, КГУ Красноярская краевая ветеринарная лаборатория, ФГУ Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория, РГУ Хакасская ветеринарная лаборатория, проведенных в гг.

При анализе материалов по распространению инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота использовали результаты вирусологических исследований, предусмотренные Стандартом МЭБ (OIE Manual, Manual of Standarts //Chapter 2.3.5., 2000; Chapter 2.10.6., 2004), а также полученные при помощи ПЦР-тест-систем на основе ПЦР для диагностики ИРТ, ВД-БС, респираторно-синцитиальной инфекции (РСИ), разработанных в ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии: Свидетельства о Госрегистрации №№ ПВР-1-2.6/01845; ПВР-1-8.9/02498 и ПВР-1-8.9/02499. При исследовании на хламидиоз использовали тест-систему «Хлаком» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Биоматериал. Выделение вируса проводили из проб носовых выделений, трахеального, бронхиального экссудатов, бронхов и легких больных и вынужденно убитых с диагностической целью животных, подозреваемых в инфицировании вирусом из нескольких областей Сибири.

Для доставки биоматериала использовали 3 метода. В двух – пробы помещали в пластиковые контейнеры и транспортировали в лабораторию в охлажденном виде на льду или в замороженном состоянии. В третьем случае их доставляли в пластиковых пробирках с транспортной средой в течение не более 24 часов с момента отбора.

В лаборатории пробы в день доставки гомогенизировали, разводили 1:10 питательной средой Игла МЕМ, центрифугировали, а надосадочную жидкость фильтровали через фильтры диаметром 0,22 - µm. Полученные суспензии исследовали методом ОТ-ПЦР. Пробы, давшие положительный результат, использовали для выделения вируса. Для этого их в объеме 0,1 мл вносили в монослой культур клеток, выращенных микрометодом в 24-луночных пластиковых планшетах или 25 см3 матрасах.

Культивирование инфицированных культур клеток проводили при 20-37оС в атмосфере 5 ±0,5% СО2 в течение 5-8 дней. Всего проводили не менее 10 «слепых» пассажей до наступления видимого цитопатического действия (ЦПД) вируса.

Для заражения культур клеток использовали три метода: с адсорбцией вируссодержащей суспензии в течение часа при +20 оС и последующим внесением поддерживающей среды с 2% эмбриональной сыворотки крови, с предварительным внесением в монослой культуры клеток 1% диметилсульфоксида (ДМСО) и адсорбцией вируссодержащей суспензии в течение часа при +20 оС и с внесением вируса без адсорбции.

Идентификация цитопатических агентов. Вируссодержащую суспензию каждого пассажа исследовали в ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса. Для выявления синцитиев под световым микроскопом просматривали фиксированные и окрашенные по Романовскому-Гимза препараты инфицированных культур клеток каждого пассажа (об. 40х, ок. 10х), выращенных в пробирках на покровных стеклах. После образования монослоя клеток его трижды отмывали раствором Хенкса и вносили вирус из расчета 1-2 ТЦД50 на клетку и добавляли питательную среду. Покровные стекла с монослоем культуры клеток извлекали из пробирок через 24;48;72;96 и 120 часов после заражения, промывали теплым раствором Хенкса и просушивали под струей теплого воздуха.

После тридцатиминутной фиксации в смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1) их промывали 70о этиловым спиртом, просушивали и окрашивали, доводя рН красителя до 7,0 при помощи 1% раствора бикарбоната натрия. Препараты погружали в краситель на 60-90 минут, затем тщательно ополаскивали теплой дистиллированной водой и высушивали.

Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства изучали по общепринятым методикам.

Изучение эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Исследования проводили на крупных молочных комплексах, средних и мелких молочно-товарных фермах в 16 административных регионах России, в том числе двух республиках, расположенных на территории Сибири, а также Республики Казахстан среди местного и импортированного скота.

Математические расчеты. Статистическую обработку проводили общепринятыми методами ( и соавт., 1962). Достоверность результатов подтверждали с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р< 0,05. Для обработки данных использовали программу «Microsoft Excel», входящую в пакет программ «Microsoft Office 7.0».

Личное участие автора. Теоретический анализ, обобщение результатов, экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно. Участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие сотрудники ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии: д-р биол. наук, проф. , ст. науч. сотр., канд. биол. наук , ст. науч. сотр., канд. ветеринар. наук и , аспирант , а также ст. науч. сотр. проблемной лаборатории ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. , которым автор выражает глубокую благодарность.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Параметры выделения респираторно-синцитиального вируса

в культурах клеток

На начальном этапе предварительному исследованию в ОТ-ПЦР подвергли 190 проб биоматериала, из них выявили положительных 38, что составило 20%. В первично-трипсинизированной культуре клеток ТБ из проб легких, бронхов и трахеального экссудата, отобранных от животных на ранней стадии развития клинических признаков, выделили 6 изолятов вируса.

Наиболее эффективным было выделение вируса при условии транспортировки проб биоматериала не дольше 24 часов с момента отбора, в охлажденном состоянии на льду или в транспортной среде, заражения двухсуточного монослоя клеток в день доставки, избегая заморозки и хранения при низких температурах.

Дальнейшую работу проводили с изолятом К-18, выделенным из легких 3-х месячного теленка с признаками интерстициальной бронхопневмонии. В связи с невозможностью получения культуры клеток ТБ, его адаптацию с целью получения стабильного ЦПД и «урожая» проводили в перевиваемых линиях культур клеток.

Наиболее чувствительной к вирусу оказалась перевиваемая линия культуры клеток ТЭБ. В ней видимое ЦПД регистрировали после 8 «слепых» пассажей. Оно проявлялось на четвертые сутки девятого пассажа в виде образования характерных синцитиев. В окрашенных препаратах наблюдали гигантские клетки, содержащие от 4-х до 10-ти ядер, формирование которых начиналось уже с 24-72 часов после заражения до наступления видимого ЦПД. Результаты ОТ-ПЦР были положительными на протяжении всех пассажей. Титр вируса на уровне девятого пассажа составил 103,5ТЦД50/мл. Наиболее эффективным способом оказалось заражение монослоя клеток с часовой адсорбцией и добавлением 2% фетальной сыворотки КРС при 37оС.

Выделенный изолят не обладал гемагглютинирующими и гемадсорбирующими свойствами в отношении эритроцитов морской свинки.

При электронной микроскопии концентрированного препарата вируса девятого пассажа выявили филаментозные вирусные частицы размером 160 нанометров, однако часть из них была повреждена.

Адаптировать вирус к другим перевиваемым линиям культур клеток при данной методике заражения не удалось. Линии Vero, FLK, Taurus, MDBK, FBN, FBTR, KCT, T-1, не поддерживали репликацию вируса, и результаты выделения в них были отрицательными. Однако чувствительность их к вирусу была различной. Так, например, результаты ОТ-ПЦР были положительными на протяжении 2 «слепых» пассажей в культурах клеток FLK, MDBK, KCT и Vero, после чего вирус не выявляли.

В результате изолят был депонирован нами в коллекции микроорганизмов ФГУ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под наименованием «Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота К-18, V-406».

2.2.1.1. Спектр чувствительных культур клеток к штаммам

респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота

При выборе чувствительной клеточной системы использовали 18 разных культур клеток, учитывая время проявления ЦПД и накопление вируса в пяти серийных пассажах. Исходный титр вируса при заражении составлял 1,5-3,0 lg ТЦД50/мл. Культивирование осуществляли при 37°С в стационарных условиях. Результаты представлены в таблице 1.

Чувствительность первично-трипсинизированных культур клеток к штаммам РС-Б и К-18. В результате установили, что штаммы РСВ КРС РС-Б и К-18 репродуцировались в культурах клеток: ТЭК, ПЭК, ЛЭК, ТБ и их субкультурах. Титры вируса были выше в первично-трипсинизированных культурах клеток ЛЭК, ПЭК и ТБ, чем в их субкультурах и ТЭК.

Чувствительность перевиваемых клеточных линий к штаммам РС-Б и К-18. Из перевиваемых культур клеток крупного рогатого скота нечувствительными к штамму РС-Б оказались четыре (FBG, FBN, FBTR, КСТ и CEF). Наибольшую чувствительность проявила линия T-I, в которой на протяжении 5 пассажей цитопатическое действие вируса было наиболее стабильным. Клеточная линия овечьего происхождения FLK также поддерживала репликацию этого штамма, титр которого в ней составил 3,74±0,12 lg ТЦД50/мл. Линии культур клеток Vero, FLK, Taurus, MDBK, FBN, FBTR, КСТ, T-1 не поддерживали репликацию штамма К-18 РСВ КРС.

Таблица 1 – Спектр чувствительных культур клеток к двум штаммам вируса РСИ КРС

(n = 18; P < 0,05)

№ п/п	Вид клеточной культуры	Наименование культуры клеток	Сроки наступления ЦПД, сутки после заражения штаммом РСВ КРС	Титр вируса в lg ТЦД50/мл (M ± m)
РС-Б	К-18	РС-Б	К-18
1	Первично - трипсинизированные	ТЭК	3-4	4-5	2,89±0,20	2,92±0,07
2	ПЭК	4-5	3-5	3,20±0,15	3,58±0,07
3	ЛЭК	3-5	4-5	3,36±0,17	4,83±0,07
4	ТБ
5	Субкультуры	ПЭК	4-5	3-4	2,87±0,07	2,83±0,07
6	ЛЭК	3-5	3-6	2,95±0,05	2,79±0,03
7	ТБ
8	Перевиваемые линии	FBG	-	-	-	-
9		FBN
10		FBTR
11		MDBK	4-6	-	1,65±0,10	-
12		T - 1	2-3	3-4	3,63±0,11	2,92±0,07
13		ТЭБ	3-5	3-5	3,17±0,07	4,58±0,07
14		Taurus	1,75±0,12	1,75±0,12
15		Vero	2-3	-	0,75±0,38	-
16		FLK	-	3,74±0,12	-
17		CEF	-	-	-
18		КСТ	-	-	-	-

Результаты исследований показали, что чувствительность культур клеток к вирусу имеет «штаммовую» зависимость, т. к. спектр чувствительных культур клеток для двух штаммов вируса оказался различным. В связи с этим дальнейшую работу проводили с использованием первично трипсинизированной культуры клеток ЛЭК и перевиваемой линии FLK.