Регуляторные механизмы иммунного ответа при внебольничной пневмонии и хронической обструктивной болезни легких у мужчин (стр. 2 )

Проведенные исследования TNF-a, растворимого рецептора к TNF-a, IL-8 и IL-2 в КВВ в фазе разгара и разрешения ВП позволили установить характерные особенности уровня секреции цитокинов непосредственно в органе поражения. В дебюте заболевания уровень TNF-a в КВВ всех больных ВП был существенно выше, чем у здоровых доноров, в то же время у пациентов с тяжелой ВП регистрировались более низкие значения TNFa (табл. 2). Значения IL-8 и IL-2 превышали аналогичные показатели контроля, количество IL-8 особенно значительно нарастало с утяжелением течения ВП, а уровень IL-2 с утяжелением заболевания снижался. Содержание растворимого рецептора к TNF-a в КВВ больных ВП достоверно повышалось с утяжелением процесса. Последнее может служить патофизиологическим механизмом развития осложнений за счет избыточной продукцией sTNF-RI и блокированием аутокринной регуляции продукции TNF-a и, как следствие, развитием медиаторной гипо-/ареактивности по одному из наиболее важных провоспалительных цитокинов.

Таблица 2

Показатели цитокинов у больных ВП в разгар заболевания в КВВ (пг/мл), (М±m)

Контингент обследованных	TNFa	sTNFa-RI (p55)	IL-8	IL-2
ВП легкая, n = 56	10,9±0,6***	12,6±0,4***	2,4±0,01*	15,2±0,7***
ВП средняя, n = 48	13,2± 0,9***	14,5±0,13***	6,9±0,03***	9,1±0,2***
ВП тяжелая, n = 37	10,2±0,4***	16,8±0,11***	11,4±0,14***	8,2±0,3***
Здоровые, n = 47	4,83±0,03	6,5±0,3	1,1±0,2	2,5±0,6

Примечание: Звездочками показана достоверность показателей здоровых к показателям групп наблюдения (*** - р<0,001; ** - р<0,01; * - р<0,05).

Разработан ускоренный метод диагностики тяжести течения ВП (Пат № 000), определены интервалы величин уровня цитокинов, являющиеся критериями тяжести течения заболевания: легкое течение ВП наблюдается при системном уровне IL-2 в интервалах от 12 до 13,2 пг/мл, IL-8 от 63,83 до 73,03 пг/мл и TNFa от 7,37 до 8,77 пг/мл, среднетяжелое - при уровне IL-2 – от 6, 07 до 7,23 пг/мл, IL-8 от 110,71 до 117,31 пг/мл, TNFa от 6,96 до 8,76 пг/мл и тяжелое диагностируется при уровне – IL-2 от 15,78 до 17,98 пг/мл, IL-8 от 146,4 до 170,2 пг/мл, TNFa от 11,73 до 12,73 пг/мл.

Диагностика тяжести течения заболевания с использованием предлагаемого метода осуществляется в течение 5 часов. Это в 14 раз ускоряет определение тяжести течения заболевания и способствует быстрому своевременному назначению адекватного лечения.

Характер межсистемных взаимодействий у больных внебольничной пневмонией. Следующий этап работы заключался в исследовании системы ПОЛ-АОЗ во взаимосвязи с иммунологическими параметрами у больных в фазе разгара тяжелой и нетяжелой ВП юношей. Использование метода математических плеяд позволило установить, что взаимосвязь показателей фагоцитарной, метаболической активности нейтрофилов, компонентов клеточного и антиоксидантного звеньев в организме здоровых юношей проявляется на уровне умеренной и слабой связи. В организме больных ВП юношей количество коррелируемых признаков и сила их взаимосвязи зависит от степени тяжести заболевания: нарастание силы связи, увеличение количества взаимосвязей происходит по мере утяжеления состояния (рис. 3,4).

При сравнении групп больных внебольничной пневмонией нетяжёлого и тяжёлого течения выявлено усиление силы связи как между изучаемыми показателями одной системы (внутрисистемные), так и межсистемные. При развитии острого воспалительного процесса одними из важных тестов, характеризующих функциональный потенциал клеток моноцитарно-макрофагального звена, являются спонтанный тест с нитросиним тетразолием (НСТ), индекс активации нейтрофилов (ИАН) и активированные показатели, выявляющие резервные возможности кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов (НСТР, ИАНР). На основании полученных данных было установлено не только нарастание силы, но и увеличение количества взаимосвязей между показателями окислительного метаболизма фагоцитов при утяжелении болезни. Так, в группе пациентов нетяжёлого течения внебольничной пневмонии плеяда (НСТ – ИАН) включала в себя пять показателей, в то время как образовавшаяся плеяда у пациентов тяжёлого течения – 14. Взаимоотношения между биохимическими и иммунологическими показателями выявили важную роль показателей антиоксидантной системы (низкомолекулярного антиоксиданта – глутатиона, ферментов «антиперекисного» звена – глутатион-пероксидазы, глутатион-редуктазы, каталазы, супероксиддисмутазы) в установлении характера межсистемных взаимодействий в различные стадии заболевания. В условиях развившегося воспалительного инфильтрата лёгочной ткани при тяжелом течении заболевания наблюдается значительная роль как провоспалительных TNFα, IL2 и IL8, так и противовоспалительных медиаторов (TGFβ и растворимого ингибитора sRITNFα).

Рисунок 3. Корреляционные плеяды иммунометаболических параметров у больных ВП нетяжелого течения

Рисунок 4. Корреляционные плеяды иммунометаболических параметров у больных ВП тяжелого течения

Ответная реакция организма юношей при остром процессе, проявляющаяся в формировании многоструктурных корреляционных систем и значительного усиления взаимосвязей между уровнем оппозиционных цитокинов, иммунной системой и ПОЛ-АОЗ, указывает на адекватность иммунного ответа, определяет характер течения заболевания и прогноз.

Особенности цитокиновой регуляции иммунного ответа у больных хронической обструктивной болезнью легких. В результате анализа лабораторных показателей, у всех 404 обследованных с ХОБЛ выявлено снижение содержания уровня клеток, несущих маркеры зрелых Т-лимфоцитов CD3 и CD4 на 35%, CD8 на 14%, что приводит к нарушению процессов регуляции через факторы межклеточной кооперации. У всех обследованных наблюдается снижение суммарного процента завершающих стадий фагоцитоза в среднем на 39% в сочетании с низким показателем фагоцитарного числа (ФЧ - 3,23±0,14), что свидетельствует о недостаточности поглотительной активности нейтрофилов и отсутствии достаточного киллинга и расщепления антигена. С помощью теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) выявлено увеличение процесса активации фагоцитоза на 38,5% у пациентов с легким течением и на 74,6 % - со среднетяжелым ХОБЛ. При этом наблюдалось снижение резерва НСТ до 1,29±0,14 в не зависимости от степени тяжести ХОБЛ, что указывает на истощение резервных метаболических возможностей нейтрофильных гранулоцитов. Сохранялись компенсаторно высокими реакции окислительного метаболизма (ИАН увеличен на 141%) у пациентов с ХОБЛ в сочетании с низким резервом ИАН (1,34±0,3). При ХОБЛ происходит миграция нейтрофилов из кровеносного русла в межклеточное пространство дыхательных путей. В данной ситуации они не только не элиминируют возбудитель, но могут обусловить дополнительное повреждение собственных тканей. В пользу последнего говорит высокий индекс патогенности К (1,18±0,06) у всех пациентов. О высокой антигенной нагрузке на организм пациента свидетельствует увеличение числа клеток с рецепторами к CD25 (рецептор к ИЛ2) и HLA-DR на 81% и 41,9% соответственно. В результате исследований у больных ХОБЛ в фазе ремиссии была зарегистрирована гиперцитокинемия за счет как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов. У пациентов с 0 и I стадиями синтез IL-8 увеличивался в 1,2 раз, TNF-α в 1,6 раз по равнению с группой здоровых (р<0,001) (табл. 3).

При II стадии ХОБЛ уровень IL-8 снизился до 5,8±0,9 пг/мл, а TNF-α увеличился в 2,8 раза, несмотря на фазу ремиссии заболевания. Неадекватные уровни IL-8 и TNF-α в группе пациентов со II стадией ХОБЛ свидетельствуют об отсутствии должного синтеза IL-8, индуктором которого является TNFα. Синтез TNF-α с быстро прогрессирующим заболеванием увеличивался в 14,6 раз, а уровень IL-8 снижался в 2,7 раз по сравнению с группой здоровых (р<0,001). Синтез bFGF в сыворотке крови больных значительно отличался от здоровых доноров и незначительно - среди пациентов с разными стадиями ХОБЛ. Среди мужчин зрелого возраста с 0 и I стадиями ХОБЛ уровень секреции bFGF повышался в 1,4 раз, а со II стадией – в 1,3 раза.

Таблица 3

Уровень цитокинов в сыворотке крови пациентов с ХОБЛ в фазе ремиссии (пг/мл), (М±m)

Контингент обследованных	TNFa	s-TNFa RI (p55)	IL-8	bFGF	TGFβ
ХОБЛ 0 и I стадии, n=340	4,3±0,3***	1523,4±11 ***	13,4 ±1,6	53,9±0,08 ***	48145±20,6***
ХОБЛ II стадия, n = 64	7,3±0,5***	2269±13 ***	5,8±0,9*	51,14±0,07***	42133±10,1***
Здоровые, n = 38	2,6±0,03	789,1±7,1	11,5±1,9	38,3±1,02	1865,4±11,3

П р и м е ч а н и е Звездочками показана достоверность показателей у пациентов с нарушениями функции внешнего дыхания к группе контроля (*** - р<0,001; * - р<0,05).

У 9,7% пациентов с нестабильным состоянием заболевания синтез bFGF значительно превышал уровни большей части обследованных и составил 65,7пг/мл. Уровень провоспалительного TGF-β в системном кровотоке снижался с тяжестью течения ХОБЛ. У пациентов с 0 и I стадиями заболевания его синтез возрастал в 25,8, со II – в 22,6 раз по сравнению со здоровыми (р<0,001). В результате анализа лабораторных показателей у обследованных с ХОБЛ выявлены различные варианты сочетания уровней секреции TGF-β и bFGF в зависимости от нарушений проходимости бронхиального дерева по сравнению с группой здоровых. Продукция TGF-β и bFGF отличалась у больных ХОБЛ с разной степенью прогрессирования бронхиальной проходимости. У пациентов с ОФВ1≥80% уровень TGF-β составил 48145±20,6 пг/мл, bFGF - 53,9±0,08 пг/мл. У пациентов с ОФВ1 < 80%, но ≥ 50 % от должного синтез TGF-β продолжал снижаться, но значения bFGF оставались на уровне показателей, характерных для легкой степени нарушений бронхиальной проходимости. У пациентов, имеющих в анамнезе частые обострения заболевания, плохо поддающиеся традиционной терапии обращало на себя внимание снижение значений TGF-β до 36018,9±10,1 пг/мл, но увеличение bFGF до 62,1±0,9 пг/мл (р<0,001). Неблагоприятным является сочетание этих двух факторов, характеризующих резкое прогрессирование заболевания. Состояние, когда у пациентов отсутствует адекватный степени тяжести синтез TGF-β, но присутствует патологическая индукция синтеза bFGF, способствует с одной стороны рецидивирующему течению хронического воспаления, с другой - активному замещению нормальной легочной ткани на фиброзную, т. е. постоянному прогрессированию необратимой бронхиальной обструкции. Уровень растворимого ингибитора sTNFα - RI (p55) у всех пациентов с ХОБЛ в сыворотке крови превышал показатели контроля. В группе больных 0 и I стадиями заболевания уровень лиганд-рецептора к TNFα увеличивался в 1,9 раз, при II стадии – в 2,9 раза (р<0,001). Растворимый ингибитор способствует длительному персистированию основного провоспалительного цитокина в системном кровотоке, приводя к возникновению некупирующегося хронического воспаления. У пациентов с нестабильным течением заболевания, наличием осложнений ХОБЛ уровень sTNFα - RI (p55) возрастал до 2648,9±0,28 пг/мл.

Исследования позволили установить характерные особенности уровня секреции цитокинов TNF-α, sTNF-α RI, bFGF и TGFβ в КВВ у пациентов с ХОБЛ, что свидетельствует о весомой роли этих факторов в патогенезе заболевания (табл.4).

Таблица 4

Уровень цитокинов в КВВ пациентов с ХОБЛ в фазе ремиссии (пг/мл), (М±m)

Контингент обследованных	TNFa	sTNFα - RI (p55)	bFGF	TGFβ
ХОБЛ 0 и I стадии, n=340	7,5±0,7 ***	15,79±0,6 ***	37,6±0,2 ***	1265,6±10,6 ***
ХОБЛ II стадия, n = 64	10,6±0,2 ***	19,3±0,3 ***	54,4±0,5 ***	1285±9,1 ***
Здоровые, n = 38	3,1±0,04	4,6±0,1	15,3±1,02	655,4±4,3

П р и м е ч а н и е: Звездочками показана достоверность показателей у пациентов с нарушениями функции внешнего дыхания к группе контроля (*** - р<0,001; ** - р<0,01; * - р<0,05).

Уже в дебюте заболевания уровень TNF-α повышен в 2,4 раза, с утяжелением процесса его синтез постепенно возрастает и достигает уже 10,6±0,2пг/мл, что в 3,4 раза выше уровня у здоровых (р<0,001). Высокая концентрация TNF-α способствует формированию бронхообструктивного синдрома, неблагоприятному течению патологического процесса и сопряжена с реакцией повреждения и воспаления. Существенная роль TNF-α и IL-8 в прогрессировании ХОБЛ доказана нами ранее. Уровни провоспалительного цитокина TGFβ и растворимого ингибитора sTNFα - RI (p55) в КВВ у всех пациентов в фазе ремиссии ХОБЛ резко превышали аналогичные показатели контроля. При этом уровень TGFβ при 0 и I стадиях заболевания возрастал в 1,9 раз и незначительно увеличивался с тяжестью заболевания, а лиганд-рецептор к TNFα увеличивался в 3,4 раза в дебюте заболевания и в 4,2 раза на стадии развернутой клинической картины ХОБЛ. Подобная закономерность зафиксирована и в секреции bFGF. В группе больных 0 и I стадиями ХОБЛ его уровень увеличивался в 2,5, при II стадии заболевания - в 3,5 раза. Гиперпродукция TNFa в сочетании с гиперсинтезом TGFβ способствует развитию отека тканей, что возможно объясняет формирование нарушений бронхиальной проходимости у больных ХОБЛ с последующим замещением нормальной легочной ткани фиброзной, чему способствует гиперсекреция bFGF. Повышенный синтез bFGF стимулирует пролиферацию фибробластов и синтез коллагена и приводит к замещению тканей легкого фиброзной тканью.

Разработан ускоренный метод диагностики ХОБЛ (Пат. № 000), основанный на определении реактивной способности ИКК вырабатывать TNF-α и IL-8: при спонтанном уровне IL-8 13,4±1,6 пг/мл, TNFa 4,3±0,3 пг/мл и индуцированном ЛПС уровне IL-8 = 26,7±1,5 пг/мл и TNFa =17,4±0,9 пг/мл – диагностируется легкая степень тяжести хронической обструктивной болезни легких, а при спонтанном уровне IL-8 = 5,8±0,9 пг/мл, TNFa = 7,3±0,5 пг/мл и индуцированном ЛПС уровне IL-8 =6,1 ±0,4 пг/мл, TNFa = 7,9±0,8 пг/мл – диагностируется среднетяжелое течение хронической обструктивной болезни легких.

Характер межсистемных взаимодействий у больных хронической обструктивной болезнью легких. Дана характеристика степени влияния иммунокомпетентных клеток, факторов межклеточной регуляции и показателей, характеризующих состояние биомембраны на течение хронического воспалительного процесса с помощью метода корреляционных плеяд. Межклеточные взаимодействия влияют на адекватность и реализацию механизмов иммунореактивности, от которых зависит степень тяжести, прогноз течения и исход хронического заболевания, а также эффективность проводимой терапии. Уже при легком течении хронического воспалительного заболевания отсутствует физиологическая стадийная активация клеток (рис.5). Имеется гипореактивность гранулоцитарных фагоцитов, а неадекватность реализации этого этапа иммунного ответа является предпосылкой формирования иммунной дисфункции в процессе осуществления адаптивного иммунного ответа. Обнаружено нарушение синтеза цитокиновых регуляторных факторов, что является причиной альтерации, переходящей в хроническую форму.

При среднетяжелом течении хронического заболевания отмечается общая иммунодепрессия, выражающаяся нарастанием субпопуляционного дисбаланса супрессорных клеток, ареактивностью клеток за счет нарушения регуляторных механизмов, истощением активности ферментов АОЗ в общей системе межклеточных взаимодействий, что является одним из механизмов разрушения мембран клеток и патологического изменения в органах. Выявлены маркеры прогрессирования хронического заболевания, утяжеляющие исходную иммунокомпроментацию с использованием корреляционного метода: снижение показателей, характеризующих звено неспецифической резистентности, дисбаланс цитокиновой регуляции, увеличение удельного веса цитотоксических Т-лимфоцитов с условно супрессирующей активностью.

Рисунок 5. Корреляционные плеяды иммунометаболических параметров у пациентов 0 и I стадиями ХОБЛ

Рисунок 6. Корреляционные плеяды иммунометаболических параметров у пациентов со II стадией ХОБЛ

Клинико-прогностическая модель формирования хронической патологии органов дыхания у мужчин. Для построения клинико-прогностической модели формирования хронической патологии органов дыхания выбраны нейроинформационные методы. Для изучения возможностей применения нейронных сетей в определении информативности показателей реактивности и получении прогноза формирования ХОБЛ были обучены 2 нейронные сети различной архитектуры. На первом этапе использовался модуль Ворда, на втором этапе - метод группового учета аргумента (МГУА). Выделенные относительные показатели важности с помощью первого модуля были использованы для обучения МГУА. В результате работы нейронной сети получены полиноминальные уравнения в группе юношей:

ВХЮ=0.12*X1-0.14*X2-0.45*X3+0.56*X6+0.23*X7-0.32*X1*X5, где Х1- СD8, X2- CD25, X3-ИАНР, X5- TGFβ, X6- sTNFαRI, X7- ГПО, 0,12 - свободный член, ВХЮ - прогностическая вероятность формирования хронической респираторной патологии у юношей (вероятность хронизации у юношей).

и группе зрелых мужчин:

ВПМ=-0.19*X2+0.28*X6+0.51*X4+0.54*X5-0.29*X5^3-0.21*X2*X4, где X2-CD4/CD8, X4- TGFβ, X5- sTNFαRI, X6- TNFα, -0,19 – свободный член, ВПМ - прогностическая вероятность прогрессирования респираторной патологии у мужчин (вероятность прогрессирования у мужчин).

Таким образом, при формировании хронического заболевания органов дыхания у юношей основополагающими факторами являются: состояние клеточного звена иммунной системы, бактерицидная активность нейтрофилов, уровни TGFβ, растворимого лиганд-рецептора к TNFα и фермента антиоксидантной защиты – ГПО; при расчёте ВХЮ, если значение ВХЮ < 15×104, то это свидетельствует о низкой степени риска развития хронической респираторной патологии; от 15,1×104 до 19×104 – об умеренной степени риска; значение ВХЮ превышающее 19,1×104 – о высокой степени риска развития хронической респираторной патологии у юношей. В прогрессировании хронического заболевания органов дыхания у мужчин, основополагающими факторами являются: соотношение CD4/CD8, уровни TGFβ, TNFα и растворимого лиганд-рецептора к TNFα; при расчёте ВПМ, если значение ВПМ< 14×107 , то это свидетельствует о низкой степени риска прогрессирования респираторной патологии у мужчин; от 14,1×107 до 24×107 – об умеренной степени риска; значение ВПМ, превышающее 24,1×107 – о высокой степени риска прогрессирования респираторной патологии у мужчин.

Разработка дифференцированных подходов иммуноориентированного лечения больных с ВП и ХОБЛ. При комплексной оценке данных проведенного клинического и иммунобиологического обследования было отмечено, что тяжесть течения респираторных заболеваний всегда коррелирует с нарушениями иммунометаболического статуса. Для выявления иммунометаболических вариантов реагирования организма на воспалительный процесс в лёгочной ткани, параметры пациентов, выделенные из общего массива исследуемых показателей методом канонической корреляции, обрабатывались методом многомерной статистики – кластерным анализом. При помощи этого метода были получены однородные группы или кластеры с учётом всех заданных переменных (исследуемых параметров). У юношей установлены 4 варианта резистентности организма на остро развившийся процесс, у зрелых мужчин в ответ на хронический процесс в легочной ткани – 3. Показатели пациентов, вошедших в кластеры, сравнивались с параметрами группы здоровых юношей.

Нами были разработаны новые подходы лечения больных ВП и ХОБЛ, выбор препаратов основывался на выявленных нарушениях функционирования систем иммунитета и ПОЛ-АОЗ, характерных для каждого варианта иммунометаболической резистентности больных мужчин.

У пациентов ВП с гипореактивным сбалансированным вариантом резистентности (23,4%) уровни ИЛ-2, TNF-α в сыворотке и в КВВ повышены. Умеренно снижены: содержание IL-8, CD3, СD4 позитивных Т-лимфоцитов и резервные метаболические возможности нейтрофильных гранулоцитов (НСТР, ИАНР) на фоне адекватных значений показателей неспецифической резистентности (ФАН, НСТ, ИАН) и сбалансированных процессов пероксидации липидов, что обуславливает целесообразность назначения цинктерала (рис.7). У больных ВП юношей с гипореактивным несбалансированным вариантом резистентности (30,5%) установлено выраженное снижение уровня IL-8, значительное угнетение клеточного звена иммунной системы (CD3, CD4) с нарушением хелперно-супрессорного соотношения Т-лимфоцитов и тенденцией к уменьшению содержания ИЛ-2 и TNF-α, клеток с рецепторами к CD25, HLA-DR, факторов неспецифической резистентности (ФАН, ФР, ФЧ) на фоне резкой разбалансировки ПОЛ-АОЗ, что обосновывает сочетанное применение цинктерала и ликопида (рис.7). У 27,5% пациентов ВП в возрасте 18-21 года выявлен ареактивный вариант резистентности, который характеризовался резко сниженными уровнями сывороточных цитокинов и цитокинов в КВВ, значительным угнетением клеточного звена иммунной системы на фоне низких функциональных возможностей нейтрофилов и несбалансированной работы системы ПОЛ-АОЗ с выраженным дефицитом восстановленного глутатиона и свидетельствует о необходимости включения в схемы традиционной терапии ронколейкина (рис.7).