Материалы по токсико–гигиенической оценке биологически активной добавки к пище эпоэкстрин (стр. 1 )

Министерство здравоохранения и социального развития РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

УТВЕРЖДАЮ Проректор по научной работе СПХФА д. м.н., профессор ______________ "___" _________ 2004 г.

материалы по токсико–гигиенической оценке биологически АКТИВНой ДОБАВки к пище

ЭПОЭКСТРИН

Санкт-Петербург

2004

Список исполнителей

И. о.зав. лабораторией фармакологических исследований, к. б.н.
Ведущий научный сотрудник, к. б.н.	(раздел 3,4)
Научный сотрудник, к. б.н.	(раздел 2)
Научный сотрудник, к. ф.н.	(раздел 4)
Научный сотрудник, к. м.н.	(раздел 2)
Доцент кафедры фармакологии, к. б.н.	( все разделы)
Ст. преподаватель кафедры фармакологии, к. ф.н.	(раздел2,4)
Ст. лаборант кафедры фармакологии	(раздел 2,4)
Ст. лаборант кафедры фармакологии	(раздел 3,4)
Студент 5 курса фармацевтического факультета	(раздел 3)
Студент 5 курса фармацевтического факультета	(раздел 3)

Содержание

	Введение
1.	Общая характеристика методов исследования
2.	Результаты исследований специфической активности и безопасности субстанции Эпотек
2.1.	Острая токсичность субстанции Эпотек
2.2.	Специфическая активность субстанции Эпотек
2.2.1.	Антигипоксическая активность
2.2.2.	Актопротекторная активность
2.3.	Субхроническая токсичность субстанции Эпотек
2.4.	Подострая токсичность по Лиму
3.	Скрининговые исследования образцов Эпотек и комбинаций на его основе
4.	Результаты исследования эффективности БАД Эпоэкстрин
4.1.	Острая токсичность БАД Эпоэкстрин
4.2.	Антигипоксическая активность Эпоэкстрин
4.3.	Актопротекторная активность Эпоэкстрин
5.	Результаты исследования токсичности Эпоэкстрин
5.1.	Субхроническая токсичность
5.2.	Подострая токсичность по Лиму
	Заключение
	Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Разработанная -Биофарм совместно с сотрудниками СПХФА биологически активная добавка к пище (БАД) Эпоэскстрин, рекомендуемая к применению в качестве общеукрепляющего средства с тонизирующим эффектом, содержит в своем составе водный экстракт листьев подорожника большого (17 мг), водный экстракт плодов лимонника китайского (5,0 мг), янтарную кислоту (50 мг). Предлагаемая пропись составлена с учетом экспериментальных данных по изучению фармакологических свойств разных композиций из перечисленных (разрешенных к применению) компонентов. Их содержание не превышает рекомендуемые нормы для БАД /1/. Тем не менее, для того, чтобы максимально исключить возможность неблагоприятных проявлений от приема БАД были проведены специальные токсикологические исследования, как самой БАД, так и ее компонентов, на двух видах животных — беспородных белых крысах самцах, белых беспородных мышах самцах. Животные получены из питомника РАН «Рапполово». Во время проведения экспериментов животных содержали на стандартном рационе в условиях вивария. До начала опытов животные проходили 2–недельный карантин.

Предварительно были проведены исследования безвредности и эффективности пищевого антиокислителя, стабилизатора и консерванта, зарегистрированного под торговым названием Эпотек (Сан-Эпид заключение 77.МО.01.915.П.000940.01.03 от 09.01.03. Изготовлен в соответствии с ТУ ).

По результатам исследования фармакологической активности (антигипоксической, актопротекторной и антиоксидантной) и токсичности субстанции Эпотек была выявлена эффективная доза, которую в дальнейшем использовали при скрининговых исследованиях образцов Эпотек для составлении комбинации и определения эффективности новой БАД.

Для оценки безвредности БАД и ее компонентов было выполнено исследование острой и подострой токсичности в соответствие с методическими рекомендациями Фармакологического комитета МЗ РФ и общими указаниями по оценке эффективности и безвредности лекарственных средств /2, 3/.

2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследований проведено изучение специфической активности новой БАД – антигипоксических свойств, актопротекторной и антиоксидантной активности; острой токсичности. Предварительно проводили исследования эффективности и безопасности субстанции Эпотек, а также скрининговые исследования различных образцов Эпотек и комбинаций на его основе для выбора оптимального количества компонентов и их соотношения.

Исследуемые вещества и БАД вводили экспериментальным животным перорально в виде водной взвеси. Для исследования каждой дозы препаратов использовали группы по 10 животных. Контрольным группам животных перорально вводили воду очищенную в эквивалентном объеме. В качестве препарата сравнения использовали настойку листьев женьшеня Фолигин, а при исследовании субстанции Эпотек препаратом сравнения служил препарат Гипоксен.

Оценка острой токсичности

Острую токсичность исследуемых веществ и новой БАД оценивали на белых беспородных мышах-самцах массой г. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. ЛД50 рассчитывали по методу Миллера-Тейнтера /4/.

Оценка антигипоксических свойств

Для экспериментальной оценки антигипоксической активности растительных экстрактов использовали основные модели гипоксии: острую гипобарическую гипоксию (ОГБГ), острую гистотоксическую гипоксию (ОГТГ), острую гемическую гипоксию (ОГГ) /5/.

Острая гипобарическая гипоксия

Моделирование ОГБГ осуществляли при помощи барокамеры с приточно-вытяжной вентиляцией и объемом рабочей камеры 0,93 м3. Постепенное разряжение воздуха в камере создавали до давления 19,4 кПа, что соответствовало 11000 м над уровнем моря (предельная “высота” для мышей). Скорость подъема животных на данную “высоту” составляла 50 м/c. Длительность пребывания животных на предельной “высоте” – 20 минут. В рабочую камеру помещали до 10 животных одновременно. Исследуемые вещества, препарат сравнения и БАД вводили перорально в виде водной взвеси за 1 час до эксперимента. Регистрировали длительность жизни и выживаемость по числу животных, выживших на предельной “высоте” 20 минут.

Острая гистотоксическая гипоксия

В основе развития ОГТГ лежит прямое воздействие различных ядов на цитохромоксидазу – фермент терминального участка дыхательной цепи, приводящее к подавлению ее активности. Типичными ингибиторами, которые вызывают ОГТГ, являются синильная кислота и ее соли – цианиды.

ОГТГ моделировали на белых беспородных мышах самцах массой г. Раствор нитропруссида натрия вводили внутрибрюшинно из расчета 20 мг/кг и наблюдали за развитием картины отравления у животных. Исследуемые вещества и БАД вводили перорально за 1 ч до инъекции нитропруссида натрия. Контрольная группа животных получала, воду очищенную, в качестве препаратов сравнения использовали настойку Фолигин и Гипоксен. Регистрировали продолжительность жизни и выживаемость животных после введения ингибитора тканевого дыхания.

Острая гемическая гипоксия (ОГГ)

ОГГ моделировали на белых беспородных мышах самцах. Нитрит натрия (300 мг/кг) вводили внутрибрюшинно, наблюдали за развитием картины отравления животных. Исследуемые вещества и БАД вводили перорально за 1 ч до инъекции нитрита натрия. Контрольная группа животных получала, воду очищенную, в качестве препарата сравнения использовали настойку Фолигин и Гипоксен. Регистрировали продолжительность жизни животных и выживаемость после введения смертельной дозы натрия нитрита.

Оценка актопротекторной активности БАД

Способность организма переносить физические нагрузки является интегральным показателем эффективности процессов обмена веществ, мобилизации адаптационных механизмов и характеризует состояние животного в период совершения «работы». Известно, что под влиянием препаратов антигипоксантов животные осуществляют больший объем физической нагрузки, чем в исходном состоянии. Одним из широко применяемых и хорошо зарекомендовавших себя методов изучения «работоспособности» является «плавательный тест» /5,6/.

Эксперимент проводили на белых беспородных крысах самцов массой г. Перед началом эксперимента проводили «тренировочное плавание» с целью адаптации животных к условиям опыта, а также для отбраковки больных животных. Плавание животных осуществляли в специально изготовленной емкости с предварительно загрязненной и подогретой до 28,0 + 0,5 оС водой. Специальная подготовка воды требовалась для увеличения смачивания шерсти крыс и предупреждения пассивного плавания без мышечных усилий. Для увеличения работы, выполняемой животным, к спине у основания хвоста прикрепляли груз (7% от массы тела). Исследуемые вещества и БАД вводили перорально за 1 час до совершения «работы». Контрольная группа животных получала, воду очищенную, в качестве препарата сравнения использовали настойку листьев женьшеня Фолигин. Плавание животных проводили до полного утомления (“отказа” от “работы”). Критерий «отказа» от «работы» – нахождение животного под водой более 60 сек.

Физическую выносливость животных оценивали по длительности плавания. Интервал в 1 час между введением препарата и тестированием был выбран на основании имеющихся данных о том, что максимальное действие большинства антигипоксантов наблюдается через час после перорального введения.

Исследования антиоксидантной активности

Оценку антиоксидантной активности проводили для выбора эффективных доз субстанции Эпотек. Оценивали активность основного фермента – супероксидисмутазы (СОД) и малонового альдегида (МДА).

Определение активности СОД в плазме крови

Количественное определение активности СОД в плазме крови основного фермента окислительно востановительных реакций дыхательной цепи, проводили спектрофотометрически. Метод основан на использовании реакции окисления кверцетина аскорбиновой кислотой (5). Расчет проводили по формуле:

Δ1 Д406 – Δ 2 Д406 х 100 , где

Δ1 Д406

Δ1 Д406 – оптическая плотность за 20 минут в контроле без СОД;

Δ2 Д406 – оптическая плотность за 20 минут в опыте.

Определения МДА в плазме крови

Количественное определение МДА (основного активного продукта перекисного окисления липидов) в плазме крови проводили спектрофотометрически. Метод основан на использовании реакции комплексообразования продутов пероксидации с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Окрашенный в розовый цвет комплекс продуктов пероксидации – МДА с ТБК имеет максимум поглощения при l = 535 нм. Для определения содержания предшественников МДА в сыворотке в пробы добавляли сернокислое железо. Это способствует разрушению комплексов – предшественников МДА и интенсификации окраски.

В первую пробу к 0,5 мл сыворотки крови, полученной после декапитации животного, добавляли 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты и 1 мл 0,6% раствора ТБК. Во вторую пробу – 0,5 мл сыворотки, 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты, 1 мл 0,6% раствора ТБК и 0,1 мл раствора сернокислого железа. Пробы нагревали на кипящей бане в течение часа, охлаждали и добавляли в каждую по 4 мл n-бутанола. После тщательно перемешивания пробы центрифугировали при 3 тыс. об/мин в течение 5 мин.

Окрашенный в розовый цвет комплекс (продукты пероксидации с ТБК) образуется в слое n-бутанола (верхний слой пробы) и имеет максимум поглощения при l = 535 нм. Расчет содержания МДА проводили с учетом коэффициента его молярной экстинкции, который равен 0,156 х 106М-1/см-1, по формуле:

Содержание МДА = (Е х Р) / К,

где Е – экстинкция пробы;

К - коэффициент молярной экстинкции ;

Р – коэффициент разведения пробы.

Исследование подострой токсичности

Исследование подострой токсичности проводили для оценки степени безвредности субстанции Эпотек. Исследуемые вещества вводили крысам самцам массой –180 г перорально (зондом в желудок) в терапевтической для крыс дозе в виде раствора один раз в день ежедневно на протяжении 14 суток. Полученные результаты сравнивали с результатами, регистрируемыми у животных, получавших растворитель (воду очищенную), используемый для приготовления раствора, и у интактных животных. Каждая группа состояла из 10 крыс.

Оценивали общее состояние животных, состояние волосяного покрова, слизистых оболочек, массу тела. Исследовали функциональное состояние сердечно-сосудистой системы, нервной, мочевыделительной систем, морфологические показатели крови. По окончании эксперимента животных умервщляли для проведения патоморфологических исследований.

Общее состояние подопытных животных, состояние их волосяного покрова и слизистых на протяжении всего эксперимента не отличалось существенно от показателей у интактных животных и крыс, получавших воду очищенную.

Оценка динамики массы тела крыс представляет собой объективный показатель, часто используемый для интегральной характеристики общетоксического действия БАД и лекарственных средств. Крыс взвешивали (утром до момента кормления) ежедневно в течение всего периода введения Эпотека.

Влияние Эпотека на функции сердечно-сосудистой системы оценивали по результатом электрокардиографического исследования путем регистрации электрокардиограммы (ЭКГ) у крыс, снятой во втором стандартном отведении на электрокардиографе «Heart Mirror 3» (Венгрия). Рассчитывали следующие показатели: частоту сердечных сокращений (ЧСС), величину зубцов R и S, интервалов PQ, QRS и QRST.

Влияние Эпотека на процессы образования и выделения мочи оценивали стандартными методами. Животных на сутки высаживали в специальные собирательные клетки. Устройство клетки позволяло собирать суточную мочу. Измеряли суточный диурез, плотность мочи, кислотность, наличие уробилиногена, билирубина, кетонов, глюкозы и белка.

Влияние Эпотека на состав форменных элементов крови оценивали стандартными методами. Количество гемоглобина определяли с помощью гемометра Сали. Подсчет лейкоцитарной формулы проводили на мазках крови, взятой из хвостовой вены крысы, окрашенных азур-эозином по Романовскому-Гимза. Определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов, время свертывания. Измерения проводили до начала эксперимента (исходные данные) и через 2 недели после начала введения Эпотека.

По окончании эксперимента крыс из контрольной группы и животных, получавших Эпотек декапитировали. Состояние внутренних органов оценивали визуально при аутопсии, измеряли массу органов и рассчитывали удельные значения этих показателей, выполняли гистологическое исследование случайным образом отобранных образцов тканей крыс. Для гистологических исследований вырезали небольшие участки тканей (толщина не более 5-10 мм), так чтобы вся структура органа попала в срез. Взятый материал этикетировали и помещали в 15 % водный раствор формалина. Далее объекты промывали, проводили через спирты возрастающей концентрации и заливали в парафин. Готовили гистологические срезы тканей с помощью микротома. Препараты окрашивали гематоксилином-эозином и исследовали с помощью светового микроскопа «Биолам».

Оценка кумулятивной активности (подострой токсичности по тесту Лима)

Кумулятивную активность определяли по тесту Лима (4, 6). Эта методика позволяет оценить кумулятивные свойства веществ. В опыте длительностью 24 ± 4 дня учитывали гибель животных при ежедневном энтеральном введении вещества в начальной дозе, равной 1/10 ЛД50, нарастающей в каждые последующие 4 дня в полтора раза по сравнению с предыдущей дозой. Полученные результаты позволяют рассчитать индекс кумуляции как отношение ЛД50 при однократном введении вещества к ЛД50 при кратном введении. Для этой цели используют методы, основанные на учете гибели животных при повторном введении фармакологического вещества (1). Если расчетный коэффициент меньше или близок к единице, то тестируемое вещество обладает кумулятивными свойствами. Чем больше полученный коэффициент, тем выше вероятность его кумуляции.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ТОКСИЧНОСТИ Субстанции ЭПОТЕК

2.1. Результаты оценки острой токсичности

Острую токсичность субстанции Эпотек оценивали на белых беспородных мышах самцах массой г. Использовали 10 групп тест-объектов, по 10 животных в каждой. Субстанции вводили в диапазоне доз от 100 мг/кг до 3000 мг/кг. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. ЛД50 рассчитывали по методу Миллера-Тейнтера. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты определения средних смертельных доз субстанции Эпотек

Препарат	Путь введния	ЛД 16 М±м, мг/кг	ЛД50 М±м, мг/кг	ЛД84 М±м, мг/кг
Гипоксен	П/о	215,0	630,0±41,0	986,7	Р>0,05
Эпотек	В/бр	425,0	461,1+26,0	500,0	Р<0,05
Эпотек	П/о	2150,0	2360±37,1	2750,0	Р<0,05

В результате исследований установлено, что пищевой антиоксидант Эпотек, прелагаемый для использования в БАД является не токсичным соединением, относится к IV классу токсичности.