Клинико-биохимическая характеристика функционального состояния печени у лиц, перенесших геморрагическую лихорадку с почечным синдромом (стр. 7 )

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Объекты исследования

Исследования проведены на базах муниципального бюджетного учреждения «Городская поликлиника № 38» г. Уфы, Республиканской клинической больницы им. (г. Уфа), Республиканского клинического онкологического диспансера (г. Уфа), кафедрах факультетской терапии, биологической химии Башкирского государственного медицинского университета.

В работе использованы амбулаторные карты и выписные эпикризы обследования 112 реконвалесцентов, перенесших геморрагическую лихорадку с почечным синдромом в средней и тяжелой формах в периоде наблюдения 2008 – 2011 г. г., проживающих в г. Уфа, которые вошли в основную группу. 80 обследованных (71,4%) составили мужчины,,6%) – женщины (рис.1). Возраст обследованных колебался от 22 до 55 лет, в среднем 37,8±2,30 год. В контрольную группу были включены 24 практически здоровых лиц, не имеющих в анамнезе ГЛПС, жирового гепатоза. Основная и контрольная группы были сопоставимы по полу и возрасту. Критериями включения в исследование были: лица, перенесшие ГЛПС в среднетяжелой и тяжелой форме более 6 месяцев назад; возраст до 55 лет; наличие УЗИ-признаков жировой инфильтрации печени. Критериями исключения из исследования были: алкогольная зависимость; вирусные и аутоиммунные гепатиты, болезнь Вильсона-Коновалова, лекарственные поражения печени, гемохроматоз, циррозы печени любой этиологии, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, наличие злокачественных новообразований, болезней крови.

Рис.1. Распределение обследованных по полу (в %).

Всем исследуемым диагноз ГЛПС был верифицирован методом иммунофлюоресценции при 4-х кратном и более возрастании их титра на этапе стационарного лечения. Наблюдаемые были разделены на 4 группы: 1-ю составили лица с катамнестическим периодом 6-12 месяцев, 2-ю – 1-3 года, 3-ю – 3-5 лет, 4-ю – 5 и более лет.

Обследования реконвалесцентов проводилось по следующему плану:

1) сбор анамнеза, клиническое обследование и проведение анкетирования;

2) определение клинико-лабораторных показателей: общий анализ крови, общий анализ мочи;

3) инструментальное обследование, включающее ультразвуковое исследование и компьютерную томографию печени;

4) исследование биохимических констант: общий белок, альбумин, фибриноген, глюкоза, мочевина, креатинин, билирубин, триглицериды, общий холестерин и его фракции; активности аланиновой и аспарагиновой трансаминаз, щелочной фосфатазы, лейцинаминопептидазы, интенсивность свободно-радикального окисления липидов, уровни гиалуроновой кислоты, ФНО-α, ИЛ-1β.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Клинические и инструментальные методы исследования

Клиническое исследование включало изучение жалоб, анамнеза жизни и заболевания, общего и локального статуса.

При сборе анамнеза особое внимание обращали на возможность перенесения вирусного гепатита, переливание крови, донорство, курсы парентеральной терапии, контакты с больными, перенесшими острый гепатит и др. Значение придавали профессии, связанной с контактом хлорорганическими соединениями, алкоголем, приёму гепатотоксичных лекарств, а также на признаки, свидетельствующие в пользу возможной малой печеночной недостаточности: слабости, вялости, повышенной раздражительности, быстрой психической истощаемости, внешне немотивированное снижение работоспособности, головные боли, потливости и лёгкое головокружение, сочетающееся с чувством тяжести в эпигастральной области и правом подреберье, неустойчивым аппетитом, металлическим или горьким привкусом во рту.

При объективном обследовании обращали внимание на состояние и окраску конъюктивы и кожного покрова, наличие или отсутствия малиново-красной пятнистой окраски кожи ладоней и стоп, гинекомастии у мужчин, «печёночного» запаха изо рта. Осуществляли тщательную пальпацию как левой, так и правой доли печени с определением их консистенции, формы, размеров, болезненности в правом подреберье.

Анкетирование пациентов проводили по шкале самооценки Спилбергера-Ханина и Гиссенскому перечню жалоб, позволяющих оценить субъективный уровень личностной и ситуативной тревожности и субъективную картину физических страданий больного.

Клинико-лабораторные исследования гематологических показателей (количества гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, лейкоцитарной формулы), общего анализа мочи проводили общепринятыми методами.

Ультразвуковое исследование печени и желчного пузыря проводилось на аппарате EnVisor C HD (Philips, Германия) с датчиком 3,5 мГц с дополнительным цветным доплеровским картированием на базе Республиканского онкологического диспансера и на аппарате УЗИ Sonoase 6000C на базе МУ «Городская поликлиника №38» г. Уфа. Оценивалась эхогенность, однородность паренхимы печени, четкость сосудистого рисунка, толщина стенок желчного пузыря, характеристика внтурипросветного содержимого.

Компьютерная томография органов брюшной полости выполнялась на компьютерных томографах LIGHTSPEED 16 SLICE (Республиканская клиническая больница им , г. Уфа) и Somatom AR.SHP Siemens (Республиканский клинический онкологический диспансер, г. Уфа) с томографическим шагом 3 мм. Определялись размеры печени, плотность паренхимы (коэффициент поглощения излучения ед. Х, норма 55-65 ед. Х), однородность структуры паренхимы, наличие портосистемного кровотока, размеры и плотность селезенки.

2.2.2. Биохимические методы исследования

Содержание общего белка, альбумина, мочевины, креатинина, билирубина, глюкозы, значения активности общей щелочной фосфатазы (ЩФ), в сыворотке крови исследовали на полуавтоматическом биохимическом фотометре RT – 1904C согласно прилагаемым инструкциям к стандартным наборам реактивов. Для определения содержания общего холестерина использовали набор реактивов «ОЛЬВЕКС диагностикум», триацилглицеридов - «Триглицериды - НОВО» (-Бест»), ОЩФ – «Liquick Cor-ALP» (Cormay), общего билирубина – «билирубин C», активности аспарагиновой аминотрансферазы (АсТ) – «Liquick Cor-ASAT» (Cormay), аланиновой аминотрансферазы (АлТ) - «Liquick Cor-ALAT» (Cormay), ЛАП - набор реагентов для определения лейцинаминопептидазы (Spinreaсt). Общий белок, альбумин, креатинин, глюкозу определяли с помощью стандартных наборов реагентов фирмы -Бест», мочевину – «Biostat – Lachema a.s»., ТБК - реагирующих продуктов – набор реагентов фирмы - Мед», фактора некроза опухоли – альфа (ФНО-α) и интерлейкина -1β (ИЛ-1β) - тест-система ТОО «Протеиновый контур».

Определение концентрации фибриногена осуществляли по методу A. Clauss в модификации T.L. Trobish [ и др., 1980].

Исследование общего холестерина проводили с использованием сопряжённых ферментативных реакций – холестеролэстеразы, холестеролоксидазы и пероксидазы. Пероксидаза катализирует образовавшийся пероксид водорода с последующим окислением 4-аминоантипирина и фенола с накоплением окрашенного продукта розово-малинового цвета с максимумом поглощения при 500 нм.

Определение холестерина ЛПВП и холестерина ЛПНП

Холестерин липопротеинов определяли после фракционирования ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП путем осаждения последних гепарином в присутствии солей марганца, с последующим отделением ЛПНП и ЛПОНП путем центрифугирования. Содержание холестерина ЛПВП, остающихся в супернатанте, исследовали ферментативной реакцией, описанной выше.

Холестерин ЛПНП определяли расчетным методом по формуле Фривальда:

ЛПНП хол. = Общий ХС – ЛПВП-хол. – ТГ/2,2 (моль/л), где

ТГ - триглицериды [, , 2000].

Триглицириды определяли ферментативным методом. Образовавшийся после ферментативного гидролиза липопротеинлипазой глицерин фосфорилируется с участием глицеролкиназы. Глицерол-3-фосфат окисляется кислородом воздуха с участием фосфоглицеролоксидазы. Выделяющийся Н2О2 при катализе пероксидазой образует с 4-хлорфенолом и 4-аминоантипирином хинонамин розово-красного окрашивания, Интенсивность окраски измеряется фотометрически при длине волны 546 нм.

Определение содержания в сыворотке крови гиалуроновой кислоты

Для определения гиалуроновой кислоты в сыворотке крови вначале проводили выделение её фракции из общих гликозаминогликанов модифицированным методом ионообменной хромотографии по М.F. Chaplin, J.F. Kennedy (1986) [, 1996]. В последующем определяли её количество по и соавт. (1990).

Подготовку сыворотки крови к исследованию проводили с помощью протеолитического расщепления белков в присутствии протеиназы К с детергентом (0,5% додецил сульфат натрия и протеиназа К V302В с содержанием более 100 мкг/мл) при t=42-45°С течение 4-х часов.

Депротеинизацию гидролиза осуществляли методом ионообменной хроматографии на микроколонке с ДЕАЕ-целлюлозой с использованием концентрированного раствора мочевины с детергентом (8М раствор мочевины, 0,05М раствор ацетата натрия, 0,5% раствор тритона Х-100, рН 6). Для этого гидролизат сыворотки разбавляли 5-и кратным количеством раствора мочевины с детергентом и заливали в хроматогрофическую колонку (высота 70 мм, диаметр 7 мм), заполненную ДЕАЕ-целлюлозой, предварительно промытую этим же раствором мочевины. Белки сыворотки крови вымывались из колонки указанным раствором мочевины со скоростью 0,2-0,4 мл/мин, контролируя содержание белка спектрофотометрически при 280 нм.

После полного удаления раствора мочевины с детергентом приступали к выделению гиалуроновой кислоты путем элюции раствором NaCl. Вначале 0,15М раствором элюировали гликопротеины, а затем 0,3 М раствором – гиалуроновую кислоту в отдельный стаканчик, выпаривали досуха и рстворяли в 2 мл дистиллированной воды и определяли в ней содержание гликозаминогликана по реакции Дише карбазоловым методом [ и др., 1990]. В две пробирки (опыт, контроль) приливали при охлаждении на ледяной бане по 1 мл раствора гиалуроновой кислоты и по 5 мл концентрированной серной кислоты, содержащей 0,2 М (9,5 г/л) буры (натрия тетраборнокислого) и пробы нагревали в течении 10 минут на кипящей водяной бане. В опытный образец после охлаждения проб добавляли 0,1 мл 0,01М (1,67 г/л) раствора карбазола в 96% этаноле, а в контрольный – 0,1 мл этанола. Содержимое пробирок перемешивали, нагревали в кипящей водяной бане 10 мин. (развивалось фиолетово-розовое окрашивание), охлаждали до комнатной температуры и фотометрировали при 530 нм против концентрированной серной кислоты, содержащей 0,2М буры. Далее находили разность величин оптических плотностей опытной и контрольной проб и определяли содержание гиалуроновой кислоты по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам гиалуроновой кислоты в мкмоль/л сыворотки.

Определение содержания фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) и интерлейкин-1-бета (ИЛ-1β) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя наборы реагентов тест-системы ТОО «Протеиновый контур» (СПб, Россия) на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Лазурит»(США).

Определение активности АлТ (КФ 2.6.1.2.) основано на измерении оптической плотности при длине волны 490 нм окрашенного в щелочной среде 2,4 – динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты.

Определение активности АсТ (КФ 2.6.1.1) осуществляли унифицированным методом Райтмана – Френкеля: образовавшаяся в результате переаминирования под действием АсТ щавелево – уксусная кислота в реакционной смеси самопроизвольно декарбоксилируется в пировиноградную кислоту. При добавлении 2,4 – динитрофенола каталитический процесс останавливается и в щелочной среде возникают гидрозоны пировиноградной и отчасти щавелево – уксусной кислот. Концентрация образовавшихся окрашенных гидразонов измеряется фотометрически при длине волны 490 нм.

Исследование активности лейцинаминаминопептидазы (КФ 3..) Метод основан на определении уровня аммиака, образующегося при дезаминировании лейцинамида, катализируемой лейцинаминопептидазой при рН 8,6. Содержание аммиака измеряется фотометрически по цветной реакции с щелочным раствором гипохлорита натрия в присутствии нитропруссида натрия.

Интенсивность свободно-радикального окисления липидов изучали методом Fе-индуцированной хемилюминесценции плазмы крови по [, , 1995] и путем определения уровня ТБК-реагирующих продуктов (малоновый диальдегид и др.).

Определение содержания ТБК – реагирующих продуктов (ТБК-рп)

Принцип метода основан на том, что вторичные продукты ПОЛ образуют с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) окрашенный комплекс, которые экстрагируются бутиловым спиртом. Оптическая плотность образовавшихся комплексов определяется фотометрически при длинах волн 535 и 570 нм. Расчет определяется по формуле:

С = D535 - D570 /0.156*k, где С – содержание ТБК-рп в опытной пробе мкмоль/л, D535 и D570 – оптическая плотность образца при 537 и 570 нм, 0,156 – коэффициент молярной экстинции малоновый альдегид – ТБК в мкмоль/см, k – коэффициент разведения образца.

Хемилюминесценцию (ХЛ) регистрировали в системе, содержащей 20 мл калий-фосфатного буфера (рН 7,45) и 1 мл плазмы крови. Свечение индуцировали добавлением 1 мл 50мМ раствора FeSO4 * 7Н2О, ускоряющего процессы ПОЛ.

Для оценки Fe2+-индуцированной ХЛ (рис. 2) определяли спонтанное свечение, величину латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки, амплитуды быстрой и медленной вспышек, светосумму свечения. Обработку хемилюминограмм производили с помощью специализированной компьютерной программы по и [, 1995]. Величины показателей выражали в условных единицах.

Рис.2. Хемилюминесценция плазмы крови в норме. Параметры хемилюминограммы: спонтанное свечение (а), быстрая вспышка (б), латентный период (в-г), медленная вспышка (д).

2.3. Статистическая обработка результатов исследования

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью профессионального пакета Statistica 6,0 фирмы Stat Soft. В группах выборки, при соответствии распределения признака закону нормального распределения, оценивали значения выборочного среднего () и стандартную ошибку среднего (sx), при ассиметрическом распределении признаков рассчитывали в группах выборки медиану (Ме) и процентили [25%;75%]. Для определения различий между двумя выборками по уровню количественно измененного признака нами применялось определение U-коэффициента Манна-Уитни, а для выявления силы и направления межгрупповой корреляции рассчитывали коэффициент Спирмена. Различия считали достоверными при уровне значимости Р ≤ 0,05.

Глава 3.Результаты собственных исследований

3.1. Общая характеристика и клинико-лабораторные показатели у лиц, перенесших ГЛПС

Всего было обследовано 112 пациентов, перенесших геморрагическую лихорадку с почечным синдромом, в возрасте 22-55 лет. Мужчины составили 71,4%, женщины – 28,6%.

В первую группу вошли 39 обследованных, во 2-ю группу – 26, в 3-ю – 19 и в 4-ю группу – 28 (рис. 3).

Рис.3 Распределение обследованных (в %) по давности перенесенной ГЛПС.

Распределение обследованных в зависимости от возраста и пола представлено на рис.4.

Лица, перенесшие среднетяжелую форму ГЛПС, составили 68,7% (77 человек), тяжелую форму – 31,3% (35 человек). Среди пациентов, перенесших тяжелую форму, у 12 в остром периоде заболевания были осложнения, такие как острая почечная недостаточность (ОПН), потребовавшие проведения гемодиализа, ДВС – синдром, отек мозга и пневмония (табл. 1).

Рис.4. Распределение обследованных по полу в разных возрастных группах.

Таблица 1.Частота осложнений ГЛПС у лиц, перенесших тяжелую форму ГЛПС

Осложнения ГЛПС	Реконвалесценты
Абс. число	%
Острая почечная недостаточность, потребовавшая гемодиализ ДВС – синдром Токсическая энцефалопатия (отек мозга) Пневмония	5 5 1 1	41,7 41,7 8,3 8,3
Итого	12	100,0

Распределение по тяжести перенесенного заболевания в каждой группе представлено на рис.5.

Рис.5. Распределение пациентов в клинических группах в зависимости от тяжести перенесенной ГЛПС.

Жалобы пациентов при обследовании были весьма разнообразными. Перечень основных жалоб, предъявляемых пациентами, и их частота в разных клинических группах в зависимости от давности перенесённого заболевания (табл.2).

Таблица 2. Перечень и частота жалоб пациентов, перенесших ГЛПС в зависимости от давности заболевания

Характер жалобы	Группы обследованных
1-я, n=39	2-я, n=26	3-я, n=19	4-я, n=28
Абс.	%	Абс.	%	Абс.	%	Абс.	%
Слабость	4	10,2	4	14,3	2	10,5	4	14,2
Вялость	4	10,2	4	14,3	2	10,5	8	28,6
Быстрая утомляемость	20	51,3	14	53,8	7	36,8	9	32,1
Ощущение усталости	4	10,2	4	14,3	2	10,5	6	21,4
Головные боли	8	20,5	10	38,5	12	63,2	11	39,3
Головокружение	4	10,2	4	14,3	-	-	1	3,6
Ощущение давления в голове	8	20,5	4	14,3	-	-	4	14,2
Плохой сон	8	20,5	14	53,8	3	15,8	8	26,6
«Расшатанность» нервной системы (нервозность)	8	20,5	4	14,3	2	10,5	3	10,7
Боли в пояснице	16	41,0	10	38,5	9	47,4	6	21,4
Отёки	-	-	4	14,3	3	15,8	4	10,7
Никтурия	4	10,2	2	7,7	-	-	-	-
Тошнота	8	20,5	6	23,1	2	10,5	8	28,6
Изжоги	8	20,5	2	7,7	2	10,5	8	28,6
Горечь во рту	4	10,2	2	7,7	-	-	7	25,0
Снижение аппетита	-	-	2	7,7	-	-	1	3,6
Запоры, жидкий стул	8	20,5	6	23,1	3	15,8	5	17,9
Чувство переполнения в животе	8	20,5	2	7,7	9	47,4	4	14,2
Боли в желудке	4	10,2	2	7,7	3	15,8	3	10,7
Боли, тяжесть в правом подреберье	4	10,2	4	14,3	3	15,8	3	10,7
Учащенное сердцебиение	11	28,2	3	11,5	3	15,8	4	7,1
Боли в области сердца	2	5,1	2	7,7	7	36,8	3	10,7
Перепады артериального давления	4	10,2	6	23,1	5	26,3	5	17,9
Одышка	4	10,2	3	11,5	2	10,5	6	21,4
Снижение зрения	11	28,2	4	14,3	2	10,5	2	-
Усиленное выпадение волос	8	20,5	3	11,5	2	10,5	1	-
Частые ангины, ОРВИ	11	28,2	12	46,2	5	26,3	2	7,1

Наиболее часто предъявляемыми жалобами у пациентов 1-й группы (через 0,5-1 год после заболевания) были быстрая утомляемость (51,3%), боли в поясничной области (часто тупые, тянущие, особенно после физической работы, 41,0%), а также учащенное сердцебиение, снижение остроты зрения, частые ангины и острые респираторные вирусные инфекции (3-5 раз в году). У значительной части реконвалесцентов наблюдались головные боли, нарушения сна, нарушения функции желудочно-кишечного тракта. Во 2-й группе обследованных (1-3 года после болезни) также превалировали быстрая утомляемость, головные боли, нарушения сна, боли в пояснице и частые ангины и простудные заболевания. Количество жалоб на состояние желудочно-кишечного тракта несколько снижалось. В 3-й клинической группе (через 4-5 лет после перенесённой ГЛПС) пациенты наиболее часто жаловались на головные боли, боли в пояснице, колющие боли в области сердца и перепады артериального давления, а также на быструю утомляемость и нарушения со стороны функции желудочно-кишечного тракта: чувство давления и переполнения в животе, боли в желудке, частые запоры и/или жидкий стул, боли или тяжесть в правом подреберье, тошноту, изжогу, отрыжку. В 4-й группе обследованных (через 5 и более лет после перенесённой ГЛПС) сохраняются головные боли, быстрая утомляемость, вялость, ощущение усталости, слабость, бессонница и другие проявления астении, на боли в поясничной области указывали лишь 1/5 часть реконвалесцентов. Остальные жалобы распределились более равномерно, кроме жалоб на тошноту и изжогу.