Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными краун-эфиров (стр. 3 )

Осуществлен синтез ряда соединений этого нового типа [30] и впервые исследованы их спектральные и фотохимические свойства. Структура одного из них — trans-1— установлена методом РСА (ІІ) [4, 31].

ІІ

trans-1

Рисунок 1.4.1 Строение trans-1 в проекции на плоскость наименьшего перекрывания.

Хромоген молекулы имеет плоское строение, определяемое, по-видимому, сильным сопряжением бензотиазольного остатка, этиленовой связи, бензольного цикла и двух атомов кислорода фрагмента бензокраун-эфира, а также характеризуется высокой степенью выровненности порядков π-связей хромофора.

Плоское строение хромогена trans-1 приводит к возникновению невалентных взаимодействий, проявляющихся в уменьшении некоторых межатомных расстояний по сравнению с суммой их ван-дер-ваальсовых радиусов и в искажении ряда углов. Существование невалентных взаимодействий между атомами Н(2) и H(6), S и Н(3), Н(3) и Н(4), атомов Н этильной группы с Н(1) и Н(2) свидетельствует о наличии значительного стерического напряжения в молекуле trans-1. Все эти закономерности строения фрагмента красителя в trans-1, по-видимому, носят общий характер для всех КСК и могут влиять на их спектральные и фотохимические свойства.

Еще одной особенностью строения trans-1 в отличие, например, от бензо-15-краун-5-эфира является ориентация неподеленных электронных пар атомов 0(2), 0(3) и О(4) макроцикла вне его полости, что указывает на необходимость изменения его конформации для эффективного связывания катиона металла при комплексообразовании. Причина этого эффекта, возможно, — электроноакцепторное влияние фрагмента красителя на связанные с бензольным циклом атомы О макроцикла.

1.5. Электронные спектры, темновое и фотоиндуцированное комплексообразование краунсодержащих стириловых красителей

КСК имеют глубокую и интенсивную окраску в желтой (420—460 нм) и красной (520—550 нм) обла­стях, которая связана с присутствием в пара-положении к двойной связи атома О (или N) краун-эфирного фрагмента. Все полученные КСК в растворе характеризуются транс-конфигурацией двойной связи. Общими свойствами КСК являются значительный гипсохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения (ДПП) и увеличение стоксова сдвига спектра флуоресценции с ростом полярности растворителя.

При облучении раствора, например, trans-2 в воде светом с λ=436 нм поглощение в области ДПП уменьшается с одновременным увеличением поглощения в коротковолновой части спектра, пока не достигается фотостационарное состояние. Обратное изменение спектра происходит при облучении того же раствора светом с λ = 365 нм вплоть до перехода в новое фотостационарное состояние. Наблюдаемые спектральные изменения связаны с протеканием обратимой фотохимической транс—цис-фотоизомеризации (рисунок 1.5.1, схема 1) [32].

Рисунок 1.5.1 Электронные спектры поглощения транс- (1) и цис-изомеров КСК 2 (2) и нескорректированный спектр флуоресценции транс-изомера 2 (3). Вода, Т - 295 К.

Схема 1

цис-2

Значения квантовых выходов как прямой, так и обратной фотоизомеризации для всех КСК в полярных растворителях близки и находятся в диапазоне 0.4-0.5. Эффективность фотореакции не зависит от наличия в растворе кислорода воздуха.

После облучения КСК в растворах происходит быстрое темновое восстановление спектров, что связано с протеканием термической цис—транс-изомеризации.

Сравнительное исследование КСК 2 и его аналога 3 показало, что макроциклический фрагмент не оказывает какого-либо специфического влияния на спектральные, и фотохимические свойства красителей [31].

Различие между этими соединениями проявилось при исследовании комплексообразования в МеCN (схема 2). Было найдено, что добавление в раствор перхлоратов щелочноземельных металлов приводит к значительному гипсохромному сдвигу ДПП trans-2, тогда как при добавлении тех же количеств солей металлов в раствор trans -3 происходят лишь незначительные спектральные изменения.

Схема 2

Как показали расчеты [4,12,13,32], ДПП в электронных спектрах КСК относится к электронному переходу с небольшим переносом заряда (-0.2 е) с бензокраун-эфира (донор) на гетероцикл (акцептор). Связывание краун-эфирного фрагмента с катионом металла приводит к появлению кулоновского взаимодействия, которое делает такое смещение электронной плотности энергетически невыгодным (электронная плотность смешается от катиона). Этим объясняется наблюдаемый экспериментально гипсохромный сдвиг ДПП.

Добавление в раствор цис-изомеров КСК перхлоратов щелочноземельных металлов обычно также приводит к гипсохромным сдвигам ДПП, однако их величины заметно уступают соответствующим сдвигам ДПП транс-изомеров. Это связано, по-видимо­му, с нарушением эффективного сопряжения в неплоском цис-изомере КСК.

С учетом известных [14] эмпирических правил для краун-эфиров более простого строения следовало ожидать, что величина сдвига ДПП при комплексообразовании КСК будет зависеть от пространственного соответствия размеров полости краун-эфира и иона металла, плотности заряда на катионе металла и природы растворителя. Действительно, Мg2+ вызывает сдвиг ДПП trans-2 в МеСN более чем на 40 нм. В то же время сдвиг ДПП trans-4 при добавлении Мg2+ составляет всего 1 нм. По-видимому, размер полости фрагмента 15-краун-5-эфира trans-2 в наибольшей степени соответствует размеру Мg2+, что и предопределяет его эффективное взаимодействие с донорными атомами кислорода краун-эфира, в том числе с атомом кислорода, находящимся в сопряжении с хромофором. Аналогично, при добавлении Еu3+ к раствору trans-4, содержащего фрагмент 18-краун-6-эфира, наблюдается значительный гипсохромный сдвиг ДПП на 44 нм. Из катионов щелочноземельных металлов наибольшим пространственным соответствием полости краун-эфира trans-4 обладает Sr2+ [33].

Сравнение катионов щелочных и щелочноземельных металлов показывает, что последние вызывают гораздо более сильные сдвиги ДПП. Соответственно, для катионов трехвалентных металлов с еще большей плотностью заряда наблюдается дальнейший рост величины сдвига.

Следует отметить, что для КСК регистрируется заметное уменьшение величины сдвига при переходе от МеСN к МeОН. Это, по-видимому, связано с темт что молекулы МеОН в большей степени, чем МеСN, конкурируют с краун-эфирами при комплексообразовании.

Можно предположить, что значения констант комплексообразования в ряду Мg2+, Са2*, Ва2+ будут симбатны величинам гипсохромных сдвигов ДПП в спектрах их комплексов с КСК. С этой целью были измерены константы устойчивости ком­плексов trans-5 с этими ионами [20].

V

Простейшей схеме комплексообразования (схема 3), в которой L — молекула красителя, М — катион металла, K1 — константа устойчивости комплекса, соответствует уравнение

См/αCL = 1+(K1C1)-1*(1-α)-1

где α — степень комплексообразования, которая вычисляется по формуле

α = (DL-D)/(DL- DLM)

(DL, D и DLM - оптические плотности исходного раствора, текущая и при полном комплексообразовании, соответственно).

Схема 3

L+ + M+ (LM)3+

Таблица 1 Константы устойчивости комплексов и изменения положений максимумов ДПП trans-5 с перхлоратами щелочноземельных металлов (См = 1∙10-2 моль∙л-1) в МеСN при Т = 295 К

Катион	CL∙10-5/моль∙л-1	lgK1	lgK2	λL - λLM/нм
Mg2+	2,1	4,5	2,8	39
Ca2+	2,0	4,0	2,8	36
Ba2+	2,0	3,7	2,8	28

На основании этих данных можно сделать вывод, что величины сдвигов ДПП симбатны lgК1 комплексов trans-5 с ионами металлов. Найденная закономерность позволяет качественно оценивать эффективность связывания КСК различными катионами металлов, по крайней мере, для красителей, содержащих только атомы О в макрогетероциклическом фрагменте.

Следует отметить, что устойчивость комплексов МиL стехиометрии 1:1с ионом Мg2+ для trans-5 почти на три порядка ниже, чем для бензо-15-краун-5-эфира (Б15К5) [20]. Этот эффект можно объяснить тем, что при переходе от Б15К5 к КСК электронная плотность на атомах О краун-эфирного фрагмента, непосредственно связанных с бензольным кольцом, значительно снижается из-за сильного электроноакцепторного влияния положительно заряженного гетероциклического остатка.

Представляло интерес исследовать стириловые красители, содержащие вместо бензокраун-эфирного N-фенилаза-15-краун-5-эфирный фрагмент. При такой замене ДПП КСК смещается батохромно (почти на 90 нм для trans-6) из-за участия неподеленной пары электронов атома азота краун-эфирного фрагмента в сопряжении с хромофором [4].

550 λ/нм

Рисунок 1.5.2 Зависимость спектров поглощения (а) и флуоресценции (b) trans-6 (СL = 1,0∙10-5 моль∙л-1) в MeCN от концентрации ионов Са2+ ( СM/CL = 50, 100, 200, 300, 400, 500) при постоянной концентрации перхлорат-ионов СА = 0,01 моль∙л-1. Пунктиром показаны вычисленные спектры комплекса

На рис. 1.5.2. представлена зависимость спектра поглощения trans-6 от концентрации ионов Са2+. Значительный ионохромный эффект, наблюдаемый в дайной системе, может быть приписан, как и в случае trans-2, комплексoобразованию катиона металла с краун-зфирным фрагментом красителя.

Измеренная в рамках простейшей схемы комплексообразования (см. схему 3) константа устойчивости для комплекса trans-6 с Са2+ (lgK = 2.4) является эффективной величиной, поскольку в расчетах не учитывался процесс ассоциации трехзарядного комплекса с ионом СlO4-. Однако можно показать, что в условиях эксперимента зависимость D от Сm должна с хорошей точностью описываться уравнением (1) с эффективной константой:

K ≈ KLM(1+KLMACL)/(1+ KMACL).

Для сравнения способности краун-эфирных фрагментов trans-5 и trans-6 к образованию комплекса с Са2+ можно оценить эффективную константу К для trans-5 аналогичным образом, используя значения lgKLM = 4.0 и lgKLMА = 2.8 (см. табл. 1). Полученная оценка показывает, что устойчивость комплексов при переходе от trans-5 к trans-6 снижается более чем на два порядка [4,20,57]. Снижение устой­чивости комплексов trans-6 относительно N-фенилаза-15-краун-5 можно объяснить сильным электроноакцепторным влиянием положительно заряженного бензотиазольного остатка в молекуле красителя.

При облучении растворов trans-6 видимым светом происходят спектральные изменения, характерные для реакции транс-цис-изомеризации. Образующийся в ходе реакции цис-изомер нестабилен и в темноте переходит в соответствующий транс-изомер [34]. Константа скорости темновой цис—транс-изомеризации более чем на три порядка выше, чем для КСК типа trans-5 [38]. Это обусловлено более высокой степенью сопряжения в хромофорном фрагменте cis-6 по сравнению с cis-5 из-за наличия атома азота с неподеленной электронной парой в пара-положении к связи С=С.

Для (cis-6) • Сa2+ кинетика темновой цис—транс-изомеризации, за которой следили по изме­нению оптической плотности раствора при 522 нм, строго соответствовала уравнению первого порядка. Зависимость была проанализирована в рамках схемы 3.

Данные при См = 0.05 моль∙л-1 показывают, что kс-t для полного комплекса много ниже, чем для свободного сis-6. Тогда при степенях комлексообразования от 0 до 0.8 отношение концентрации свободного цис-изомера к его общей концентрации в растворе можно принять равным отношению текущего значения kс-t к k0c-t при См = 0.

Рисунок 1.5.3 Экспериментальная (точки) и теоретическая (уравнение (1)) (кривая) зависимости константы скорости темновой цис—транс-изомеризации в МеСN красиCL= 1.0∙10-5 моль∙л-1) от концентрации ионов Са2+ при постоянной концентрации Cl04- (СА = 0.01 моль∙л-1)

Из рис. 1.5.3 видно, что экспериментальные точки хорошо ложатся на теоретическую кривую. Константа устойчивости lgК комплексов cis-6 с Са2+, полученная при аппроксимации, составляет 2.85.

При переходе trans-6 в цис-форму устойчивость комплексов возрастает в 2.5 раза. Этот небольшой эффект обусловлен, по-видимому, ослаблением электроноакцепторного влияния положительно заряженного бензотиазольного остатка на связывание катиона металла, так как известно, что в цис-изомерах алкенов по сравнению с транс-изомерами эффекты заместителей передаются через связь С=С хуже. Другой причиной этого ослабления может быть нарушение сопряжения в цис-6 из-за его неплоского строения.

Тиакраун-соединения мало изучены, хотя они имеют значительные преимущества перед кислородными и азакраун-эфирами, поскольку обладают повышенной склонностью к образованию комплексов с тяжелыми и переходными металлами [35, 36, 39, 52, 54, 55, 58].

Таким образом, функциональные возможности КСК до проведения вышеупомянутых работ не изучались. Удалось обнаружить целый ряд новых эффектов и исследовать механизмы связанных с ними процессов, среди которых наиболее перспективными являются ион-селективное образование анион-«накрытых» комплексов и стереоспецифическое ион-селективное авто-ФЦП КСК. Полученные результаты позволяют прогнозировать возможность использования КСК для создания селективных хромо - и флуороионофоров, в том числе для катионов большого ионного радиуса, небольших органических катионов тяжелых металлов; фотохромных ионофоров для фотоуправляемого ионного транспорта через мембраны; полимерных пленок и пленок ЛБ с фотопереключаемыми свойствами; фотопереключаемых синзимов и молекулярных устройств для молекулярной электроники. Можно надеяться, что супрамолекулярная органическая фотохимия КСК будет развиваться далее и эти системы найдут практическое применение.

1.6. Полимерные пленки, содержащие производные краун-эфиров

Теперь рассмотрим полимерные матрицы на основе готовых полимеров, растворенных в соответствующих растворителях. Надо сразу оговориться, что подобные матрицы, как правило, не служат моделями биомембран, однако они перспективны как компоненты наноматериалов для создания хемосенсоров. Их цель – быстрое и высоко достоверное улавливание даже самых низких концентраций веществ в различных средах.

Важным достоинством метода получения пленок из раствора [5] является то, что отлив пленок производится при сравнительно низкой температуре, возможно введение нетермостойких добавок, определяющих дальнейшее применение пленки (пластификаторов, красителей, лекарственных препаратов и т. п.). При этом важно отметить, что существует возможность задавания необходимой толщины пленки, встраивания кроме КЭ дополнительных компонентов в структуру пленки (например, пластификаторов). Это достигается с помощью отработанного метода полива пленок, суть которого заключается в равномерном распределении раствора полимера со смешанным с ним раствором КЭ, а также растворов других компонентов на поверхности подложки. Однако, несмотря на видимую простоту метода, требуется подобрать к соответствующему КЭ полимер, оптимальные растворители и другие компоненты. Важно отметить, что необходимо подбирать оптимальные концентрации веществ в соответствующих растворах. Так растворение полимера принципиально отличается от растворения низкомолекулярных веществ, что необходимо учитывать при подборе оптимальных концентраций раствора полимера. Полимеры в растворах, особенно концентрированных, образуют структуры, форма и размер которых зависят как от характера взаимодействия полимера с растворителем, так и от условий, в которых находится раствор (температура, механическое воздействие). Принципиальное различие в механизме растворения низкомолекулярных веществ и полимеров заключается в том, что низкомолекулярное вещество диффундирует в растворитель, а в случае высокомолекулярных соединений растворитель проникает в полимер [5].

Растворение полимеров происходит в две стадии:

1)  набухание полимера вследствие проникновения малых частиц растворителя; оно вызвано большой разницей в коэффициентах диффузии полимера и растворителя;

2)  собственно растворение, заключающееся во взаимодиффузии полимера и растворителя, приводящей к разделению элементов структуры полимера и образованию истинного раствора.

В связи с этим выгодно использовать смесь растворителей, из которых один обладает лучшим сродством к полимеру, а другой — лучшими кинетическими свойствами (небольшие компактные молекулы, легко проникающие в полимер).

1.7. Методы определения ионов кальция

Оценка методов оптического контроля компонентов биологических жидкостей.

Контроль компонентов биологических жидкостей, и в частности биологически активных соединений крови, занимает особое место и очень важен как для оценки физиолого-биохимического статуса организма, так и для своевременной диагностики патологических состояний организма человека и животных. Среди множества биохимических показателей, которые исследуются в современной медицинской практике оптическими методами, наиболее перспективными являются определения таких соединений как стероиды и катионы биологически важных металлов (натрия, калия и кальция). Среди названных металлов для данного проекта особой строкой можно выделить кальций. Роль кальция в метаболических процессах многообразна: он является основным элементом костной ткани, играет важнейшую «регуляторную» роль внутри клеток. Ионы кальция принимают участие более чем в 30 химических реакциях организма. Кроме того, определение кальция важно для внутрисосудистой диагностики атеросклероза, что является основной задачей, на решение которой направлена работа.

В настоящее время из всего многообразия оптических методов количественного определения стероидов в биологических объектах – прежде всего в крови - наиболее эффективными являются иммуноферментный, радиоиммуноферментный и люминесцентный иммуноферментный (аналитическая чувствительность достигает 8.7 пмоль/л) методы анализа [15].

В качестве иллюстрации приведем тест–систему «19-Нортестостерон–ИФА». Она предназначена для количественного определения 19-нортестостерона в физиологических жидкостях, органах и тканях животных методом иммуноферментного анализа на стрипованных полистироловых планшетах. Предел обнаружения в биологических жидкостях 0,4- 0,5 мкг/л при длине волны измерения 450 нм.